王德獎 ,李 挺 ,徐穎怡 ,楊雪雯 ,何銘垣 ,張智勇 ,吳 煒,燕 翼

廣州醫(yī)科大學(xué)1附屬第三醫(yī)院心血管內(nèi)科,2再生醫(yī)學(xué)與3D打印轉(zhuǎn)化研究中心,廣東 廣州 510150；3南方醫(yī)院器官衰竭防治國家重點實驗室,廣東 廣州 510515；4南方醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室//廣東省醫(yī)學(xué)休克微循環(huán)重點實驗室,廣東 廣州510515

冠心病是世界范圍內(nèi)困擾人類健康的最高發(fā)心血管疾病,目前臨床上最有效的治療策略是通過溶栓或經(jīng)皮冠狀動脈介入治療恢復(fù)對缺血心肌的再灌注,以減輕急性心肌缺血性損傷［1］。然而心肌再灌注本身會導(dǎo)致進(jìn)一步的心肌細(xì)胞死亡,這種現(xiàn)象被稱為心肌再灌注損傷［2-3］。盡管隨著經(jīng)皮冠狀動脈介入治療技術(shù)的進(jìn)步以及抗血小板、抗血栓藥物的發(fā)展,心肌再灌注過程不斷改善,但目前尚無有效的預(yù)防心肌再灌注損傷的治療方法。

PRP 最初稱為濃縮血小板,其歷史可以追溯到1970年代［4］。血小板中富含多種細(xì)胞因子,包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β),血小板衍生生長因子(PDGF),胰島素樣生長因子(IGF),成纖維細(xì)胞生長因子(FGF),表皮生長因子(EGF),血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(ECGF)等,這些細(xì)胞因子在細(xì)胞增殖、趨化性、細(xì)胞分化和血管生成中起重要作用［4-5］。已證明PRP在肌腱和肌肉修復(fù)中發(fā)揮積極作用,增強(qiáng)血管生成,并誘導(dǎo)修復(fù)細(xì)胞向注射部位遷移［6-9］。基于PRP對骨骼肌組織的強(qiáng)大修復(fù)作用,我們推測PRP是否對心肌再灌注損傷同樣具有保護(hù)作用。已有文章報道PRP在大動物心肌梗死模型中,可以促進(jìn)血管生成,減緩心臟重塑和改善心功能的作用［10］,但尚未發(fā)現(xiàn)PRP與急性再灌注損傷治療的相關(guān)報道。AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)已經(jīng)有許多研究發(fā)現(xiàn)與減輕心肌缺血-再灌注損傷密切相關(guān)［11-12］,而VEGF又與AMPK的激活有關(guān)［13］,同時PDGF、VEGF、FGF和EGF又可以減輕心臟缺血相關(guān)損傷［13-16］,考慮到PRP中存在的大量生長因子,我們認(rèn)為二者可能存在潛在的聯(lián)系。

基于PRP的諸多優(yōu)點,本研究分別對離體心肌細(xì)胞進(jìn)行缺氧/復(fù)氧(H/R)處理、并采用大鼠建立急性缺血-再灌注損傷模型,通過比較生理鹽水和PRP的治療效果及產(chǎn)生的分子生物學(xué)效應(yīng),解析PRP對缺血心肌組織可能的保護(hù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級健康成年SD大鼠50只,雄性,體質(zhì)量180～220 g,購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心,許可證號:SCXK(粵)2018-0002。購回后每5只飼于1籠,讓動物自由攝食、飲水,12 h/12 h明暗交替環(huán)境,溫度20～22 ℃,濕度50%～60%,適應(yīng)3 d 后進(jìn)行試驗。本研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑及儀器

BCA試劑盒(Bioworld)；CCK-8試劑盒(Dojindo)；PDGF-BB 和TGF-β1 Elisa 試劑盒(CUSABIO)；10%CaCl2、0.25%胰蛋白酶、0.2%膠原酶II、DNA 酶均(北京 索萊寶)；PE-CD86 抗體、FITC-CD206 抗體均(BioLegend)；大鼠肌鈣蛋白I(Elabscience)；AMPKα抗體、Phospho-AMPKα Thr172抗體、β-actin抗體和二抗(CST)；Sarcomeric Alpha Actinin 抗體和Donkey Anti-Rabbit IgG H＆L(Alexa Fluor?647)抗 體 自(Abcam)。

1.3 PRP的制備

將10只雄性SD大鼠按50 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉。用含3.8%檸檬酸鈉的真空管采集腹主動脈血,全血/檸檬酸比為9∶1,然后離心3次。第1次1000g離心15 min。將稀薄的紅細(xì)胞層及以上的部分轉(zhuǎn)移到另一個離心管中,然后在300g的條件下離心5 min。將紅細(xì)胞上方的上清液小心地轉(zhuǎn)移到另一個離心管中,這一步將去除大部分紅細(xì)胞,提高PRP的純度。最后1次1200 g,10 min離心,保留底部PRP,按全血/PRP=10/1 的比例去除多余的上清液(platelet-poor plasma,PPP),將全血、上清和PRP 送入檢驗科進(jìn)行血小板計數(shù),SD大鼠全血血小板計數(shù)為560×109±35×109/mL,PPP計數(shù)為(30±5)×109/mL。利用PPP將PRP中的血小板顆粒統(tǒng)一稀釋至(3000±35)×109/mL,室溫下用10%CaCl2激活4 h 后,用0.22 μm 過濾嘴過濾,分裝-80 ℃保存。

1.4 PDGF-BB和TGF-β1的測定

血小板被激活后,α顆粒中的各種生長因子和細(xì)胞因子被釋放。為了確定我們制備的PRP的有效性,我們使用了酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測了大鼠全血和激活后PRP中PDGF-BB和TGF-β1的濃度。

1.5 心肌細(xì)胞的分離

如前所述,從1～3 d大的SD大鼠的心室中制備新生大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)物［17］。從新生大鼠中無菌取出心室組織,切碎,然后在37 ℃的振蕩浴中用混合蛋白酶(0.25%胰蛋白酶,0.2%膠原酶II,100 μg/mL DNA酶I和D-Hanks溶液)消化。第1次消化后釋放細(xì)胞,然后將消化后的細(xì)胞添加到補充有10%胎牛血清的相同體積的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中,直至收集所有細(xì)胞。通過以1200 r/min離心5 min來沉淀細(xì)胞,并重懸于補充有10%胎牛血清的DMEM中。最后,將分離的細(xì)胞置于含有95%空氣和5%CO2的培養(yǎng)板中,并在37 ℃下培養(yǎng)1 h 15 min以排除非心肌細(xì)胞。然后收集懸浮細(xì)胞,并以1×105/孔接種于96孔板和3×106/孔接種于6孔板上,并保持在與上述相同的培養(yǎng)條件。2 d后在以下實驗中使用心肌細(xì)胞。

1.6 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧方案和分組

將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行H/R以模擬體內(nèi)心肌缺血-再灌注損傷。為了誘導(dǎo)缺氧,將心肌細(xì)胞培養(yǎng)基替換為不含胎牛血清的無糖培養(yǎng)基,然后轉(zhuǎn)移到95%N2和5%CO2的三氣培養(yǎng)箱中(Thermo Fisher)。缺氧3 h后,向培養(yǎng)皿中加入不同體積含量的PRP(1%、5%、10%、20%),Control組為生理鹽水,并轉(zhuǎn)移至裝有95%空氣和5%CO2的常氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行12 h的復(fù)氧。

1.7 細(xì)胞活力/細(xì)胞增殖測定

根據(jù)制造商所提供的CCK8說明書檢測各組細(xì)胞活力。向96孔板的每個孔中加入10 μL CCK-8溶液,然后在37 ℃下孵育2 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量各孔的光密度。

1.8 心肌細(xì)胞的免疫熒光

在不同組中處理后,將細(xì)胞用PBS洗滌兩次。然后使用4%多聚甲醛固定15 min。再次用PBS洗滌后,將溶解在包含0.3%Triton X-100和10%山羊血清的復(fù)合物中的一抗Sarcomeric Alpha Actinin(1∶800)于4 ℃過夜。再次洗滌細(xì)胞,并在室溫下用二抗-驢抗兔Alexa Fluor 647(1∶500)處理30 min。為了觀察細(xì)胞核,最后將固定的細(xì)胞與4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)孵育10 min。

1.9 蛋白質(zhì)印跡

用BCA 試劑盒對細(xì)胞裂解液進(jìn)行定量,然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,將其印跡在硝酸纖維素膜上。將膜與抗體AMPKα、Phospho-AMPKα Thr172和β-actin 4度過夜孵育,第二天洗膜后和二抗室溫孵育1 h,再次洗膜后在ChemiDoc MP采集系統(tǒng)(Bio-Rad)上用Clarity Western ECL底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。

1.10 劃痕實驗

大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞系(RAOECs)購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC),以1×106/孔的密度接種于6孔板中。貼壁8 h后,使用200 μL槍頭尖端產(chǎn)生細(xì)胞單層劃痕。用Zeiss倒置顯微鏡觀察拍照,每3 h拍照1次,觀察12 h。使用非遷移面積除以基線面積之比來計算遷移效果。

1.11 動物缺血-再灌注模型建立及分組

大鼠用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后氣管插管,機(jī)械通氣,左胸骨旁切開顯露心臟,左冠狀動脈前降支(LAD)區(qū)域進(jìn)針,在縫線上放置圈套,收緊圈套,造成局部心肌缺血30 min,恢復(fù)再灌注后,立刻在結(jié)扎區(qū)周圍4個部位注射100 μL 的生理鹽水(Control 組)或PRP(PRP組)。1 d后后各組取6只大鼠使用戊巴比妥鈉麻醉處死,收集心臟及血液上清,剩余大鼠于1周后進(jìn)行心功能檢測。

1.12 TTC染色

在再灌注24 h后,將大鼠麻醉通過腹主動脈采集血液后,取下心臟并用生理鹽水灌流沖洗心臟內(nèi)血液,之后將心臟組織連續(xù)切成4～5片,厚度為1 mm,將其與1%2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)37 ℃水浴20 min,然后在4%多聚甲醛中固定,翌日行體視顯微鏡拍照。

1.13 肌鈣蛋白I(Troponin I)測定

再灌注24 h候后收集Control組和PRP組動物的血清,通過酶聯(lián)免疫法測量肌鈣蛋白I的濃度。

1.14 超聲心動圖評估左心室結(jié)構(gòu)和功能

使用Vevo 2100 高分辨率體內(nèi)成像系統(tǒng)(Visual Sonics,Toronto,ON,Canada)在心肌缺血造模前獲得超聲心動圖圖像。缺血-再灌注損傷1周后,再次進(jìn)行超聲測量和分析。

1.15 組織病理學(xué)染色

超聲心動圖評估后處死大鼠,依次用生理鹽水和10%多聚甲醛清洗心臟后,將心臟置于10%多聚甲醛溶液中室溫固定24 h。石蠟包埋心臟組織,切成4 μm切片,蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.16 流式細(xì)胞術(shù)

RAW264.7細(xì)胞(購自ATCC)缺氧3 h后,加入生理鹽水或1%體積PRP 復(fù)氧培養(yǎng)24 h,按照標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行免疫染色,并使用1%牛血清白蛋白(BSA)阻斷非特異性抗體結(jié)合。PE-CD86(1∶100,BioLegend,105007)和FITC-CD206(1∶100,BioLegend,141703)用于標(biāo)記M1 和M2 亞群。使用Accuri C6 流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)分析細(xì)胞,每個樣品至少分析10 000個細(xì)胞。使用BDAccuri C6 Plus軟件分析結(jié)果。

1.17 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,組間比較采用成組t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,箱線圖表示整體數(shù)據(jù),其他圖形數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。圖片的采集和處理 使 用Graph Pad Prism5.0、Image Pro Plus6.0 及MetaMorph7.1.3.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 PRP中PDGF-BB和TGF-β1濃度顯著高于全血濃度

酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果顯示PRP中PDGF-BB和TGF-β1的濃度顯著高于全血(圖1A、B,P<0.01),PRP的有效成分及濃度符合實驗條件要求［4］。

圖1 大鼠PRP和全血中相關(guān)因子的濃度Fig.1 Concentrations of PDGF-BB(A)and TGF-β1(B)in rat PRP and whole blood(n=6).**P<0.01.

2.2 PRP顯著減少H/R造成的心肌死亡,效應(yīng)與AMPK的活性增強(qiáng)相關(guān)

體外利用H/R模擬體內(nèi)缺血再灌住損傷,細(xì)胞活力檢測發(fā)現(xiàn),與Control組相比,PRP顯著減少了復(fù)氧損傷造成的心肌細(xì)胞死亡。我們發(fā)現(xiàn)1%體積PRP時心肌細(xì)胞活力最高(圖2A)。同時對心肌細(xì)胞進(jìn)行了免疫熒光染色(圖2B),結(jié)果顯示PRP 組存活細(xì)胞顯著多于Control組(177.2±7.43vs69±4.95,P<0.001,圖2C)。我們提取了兩組心肌細(xì)胞的蛋白,并檢測AMPK及其磷酸化水平,結(jié)果顯示在AMPK的表達(dá)上兩組無明顯差異,而PRP組檢測到AMPK發(fā)生了磷酸化,Control組卻并未檢測到明顯磷酸化反應(yīng)的發(fā)生(圖2D)。

圖2 PRP對缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of PRP on viability of cardiomyocytes with hypoxia/reoxygenation injury.A:Viability of the cardiomyocytes treated with different proportions of PRP for 12 h after 3 h of hypoxia,with saline as the control(n=4).B:Immunofluorescence staining of the cardiomyocytes treated with saline or 1%PRP(blue shows DAPI staining and red sarcomeric α-actinin).C:Quantitative analysis of the cardiomyocytes (in 5 randomly selected fields of view).D:Western blotting for detectingAMPK and its phosphorylation in the cardiomyocytes.****P<0.001 vs control group.

2.3 PRP促進(jìn)RAOECs的增殖與遷移

RAOECs以8000/孔接種于96孔板,過夜后第2天分別給予生理鹽水(Control組)和1%體積的PRP(PRP組),12 h后檢測細(xì)胞活力,與Control組相比PRP處理組的RAOECs顯著增殖(圖3A,P<0.001)。同時劃痕實驗發(fā)現(xiàn)PRP處理組的RAOECs在12 h明顯遷移(圖3B、C,P<0.001)。

圖3 PRP對RAOECs增殖和遷移運動的影響Fig.3 Effects of PRP on proliferation and migration of RAOECs.A:Viability of the endothelial cells treated with saline or PRP for 12 h(n=4).B,C:Migration test of the endothelial cells(n=5).****P<0.0001 vs control group.

2.4 PRP治療減輕冠脈缺血-再灌注大鼠的心肌損傷和梗死面積

冠脈前降支缺血-再灌注24 h后,收集Control組和PRP組的血清,檢測肌鈣蛋白I的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRP 組的肌鈣蛋白I 的濃度明顯低于Control 組(P<0.001,圖4A)。心臟TTC染色顯示PRP組梗死面積明顯低于Control組(P<0.001,圖4B、C)。

圖4 PRP對缺血-再灌注損傷動物肌鈣蛋白I和梗死面積的影響Fig.4 Concentration of troponin I and cardiac infarct size in the rats.A:Serum troponin I level in the control group and PRP group at 24 h after reperfusion (n=5).B:TTC staining of the cardiac tissues in the control group and PRP group at 24 h after reperfusion.C:Quantification of the infarct size(percentage of the infarct area in the entire heart section)(n=6).****P<0.001 vs control group.

2.5 PRP治療明顯改善心肌缺血-再灌注損傷動物的心功能

分別術(shù)前和術(shù)后1周檢測大鼠心功能,與術(shù)前相比,術(shù)后EF 明顯減低,LVIDs 和LVIDd 均明顯擴(kuò)大,動物心功能明顯下降。術(shù)后1周,相比于Control組,PRP治療組心功能顯著改善。射血分?jǐn)?shù)(EF)(P<0.001,圖5B)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)(P<0.001,圖5C)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)(P=0.009,圖5D)均顯著改善。

圖5 PRP對心肌缺血-再灌注損傷大鼠心功能的影響Fig.5 Effect of PRP on left ventricular function in rats after myocardial-ischemia reperfusion.The cardiac function of rats was measured before operation and one week after reperfusion,Representative M-mode echocardiography (A),EF (B),LVIDs (C)and LVIDd(D)at 1week(n=8).****P<0.001 or ***P<0.001 vs Baseline group,**P<0.01.

2.6 PRP通過調(diào)控巨噬細(xì)胞M1/M2型極化,減輕再灌注損傷心肌的急性炎癥反應(yīng)

動物HE染色(圖6A)顯示,對照組心肌細(xì)胞明顯腫大,排列雜亂,部分心肌纖維出現(xiàn)斷裂,可見明顯大片的炎性細(xì)胞浸潤；而PRP組心肌細(xì)胞略腫大,排列稍雜亂,心肌纖維斷裂較對照組明顯減少,炎性細(xì)胞浸潤面積顯著減小。

我們使用了RAW264.7細(xì)胞檢測不同刺激條件下M1/M2巨噬細(xì)胞的極化情況。結(jié)果顯示H/R后生理鹽水處理組M1型巨噬細(xì)胞(CD86)顯著增加,而相比于生理鹽水處理組,PRP處理組M1型巨噬細(xì)胞明顯減少(4.425±0.602vs7.6±0.804,P=0.002,圖6B、D)。同時檢測M2型巨噬細(xì)胞(CD206)發(fā)現(xiàn),單純生理鹽水處理后M2 型巨噬細(xì)胞數(shù)目較少,而PRP 處理后M2 型巨噬細(xì)胞顯著增多(2.65±0.342vs0.65±0.208,P<0.001,圖6C、E)。PRP處理組M1/M2比值較對照組明顯降低。

圖6 PRP對炎癥免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的影響Fig.6 Immunomodulatory effects of PRP on polarization of the macrophages.A:HE staining of the macrophages at 1 week.B,C:Flow cytometry of M1 and M2 macrophages,respectively.D,E:Quantitative histogram of M1 and M2 macrophages,respectively(n=4).****P<0.001 OR***P<0.001 or**P<0.01 vs No H/R group.

3 討論

再灌注損傷一直是急性冠脈綜合征治療中亟待解決的臨床難題,有證據(jù)表明,心肌通過合成和響應(yīng)多種應(yīng)激誘導(dǎo)的生長因子和細(xì)胞因子來適應(yīng)局部缺血/再灌注,識別這些因子構(gòu)建的炎癥內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)機(jī)制可能為限制缺血/再灌注損傷開辟新的途徑［18-19］。

在細(xì)胞H/R實驗試驗中,PRP明顯減少了復(fù)氧所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞死亡,而動物實驗也再次證實了這個觀點。PRP主要成分是多種生長因子,我們檢測了PRP中PDGF-BB和TGF-β1的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度遠(yuǎn)高于全血,這些增高的生長/炎癥因子可能對再灌注損傷心肌發(fā)揮了重要的保護(hù)作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在PDGF-AB和-BB配體在微血管和心肌細(xì)胞存活、內(nèi)皮修復(fù)、血管穩(wěn)定性、炎癥抑制以及心肌細(xì)胞收縮功能中起關(guān)鍵作用［20-21］。而TGF-β1在心肌梗死后愈合發(fā)揮關(guān)鍵作用,TGF-β1可以通過經(jīng)典(Smad3)和非經(jīng)典(ERK1/2和Akt)信號通路阻止模擬缺血-再灌注引起的心臟成纖維細(xì)胞凋亡［23］,也有文章報道TGF-β1不利于遠(yuǎn)期預(yù)后,考慮心臟是多種細(xì)胞集合的器官,我們認(rèn)為在再灌注損傷所造成非心肌細(xì)胞的死亡也是不利的,應(yīng)該盡可能減少再灌注時心臟組織的損傷和凋亡,對于TGF-β1可能存在遠(yuǎn)期不良,需要構(gòu)建慢性模型進(jìn)一步研究。我們雖只測量了PRP中PDGF-BB和TGF-β1,但PRP中生長因子遠(yuǎn)不止這些,FGF、VEGF和EGF也都大量存在［24］且與再灌注損傷密切相關(guān),這些因子同樣可以減輕心臟缺血-再灌注損傷［13,15-16,25］。

此外,本研究還檢測了心肌細(xì)胞中AMPK及其磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRP組發(fā)生了AMPK的磷酸化現(xiàn)象。眾所周知AMPK與能量代謝密切相關(guān),已經(jīng)有實驗報道心肌缺血再灌注時AMPK激活可以減少心肌細(xì)胞凋亡［26］,在AMPK敲除小鼠心臟進(jìn)行缺血-再灌注后細(xì)胞凋亡和功能障礙增加［27］,這也說明了PRP保護(hù)作用可能與AMPK 激活有關(guān)。同時AMPK 的激活導(dǎo)致eNOS磷酸化并產(chǎn)生NO［28］,NO具有多種多種心血管保護(hù)效應(yīng)。本研究也發(fā)現(xiàn)經(jīng)PRP處理組RAOECs增殖和遷移都顯著增強(qiáng),內(nèi)皮細(xì)胞與血管形成密切相關(guān),缺血部位血管密度增高不僅可以改善遠(yuǎn)期心功能,也可以減輕纖維細(xì)胞引發(fā)的不良重塑。

缺血-再灌注模型構(gòu)建1周后,PRP組相比于生理鹽水組心功能顯著改善,HE染色顯示生理鹽水組存在大片的炎性細(xì)胞浸潤,而PRP組炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。受傷組織的修復(fù)取決于炎癥免疫調(diào)節(jié)的程度和進(jìn)程,特別是對炎癥損傷的抑制作用。該過程伴隨著恢復(fù)組織完整性的間充質(zhì)細(xì)胞的活化。促炎信號的抑制不是一個被動過程,而是需要誘導(dǎo)抑制分子和激活抑制途徑［29］。在受損組織中,過度活躍、持續(xù)或空間擴(kuò)張的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致更嚴(yán)重的損傷和功能障礙,受損心臟的炎癥抑制缺陷可能會產(chǎn)生災(zāi)難性的后果,包括心肌細(xì)胞的喪失、收縮功能的抑制、基質(zhì)降解所致的房室擴(kuò)張、組織分解增加,以及將纖維化改變擴(kuò)展到了最初的梗塞范圍之外［30］。炎癥反應(yīng)的抑制受損,過度活躍的炎癥信號導(dǎo)致心肌梗死后左心室擴(kuò)張增加［31-32］。有證據(jù)表明,巨噬細(xì)胞的吞噬活性對于調(diào)節(jié)其表型和抑制炎癥反應(yīng)具有重要意義。巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的有效清除(稱為胞吐)激活了促分解信號,這可能有助于炎癥向修復(fù)的轉(zhuǎn)變。巨噬細(xì)胞中酪氨酸蛋白激酶Mer的誘導(dǎo)似乎對心肌細(xì)胞胞吐和隨后抑制梗死后炎癥反應(yīng)具有重要意義［33］。MI型巨噬細(xì)胞主要在炎癥初期產(chǎn)生大量促炎因子TNF-α、IL-12及iNOS,而過度的炎癥反應(yīng)對于心肌修復(fù)是不利的,需要及時抑制M1細(xì)胞從而向增殖期過度［30］,此時M2型巨噬細(xì)胞很好抑制了炎癥,減少炎癥所導(dǎo)致不良結(jié)果［34-35］。本研究發(fā)現(xiàn)PRP處理后炎性細(xì)胞浸潤面積和M1巨噬細(xì)胞減少,而M2型巨噬細(xì)胞增多,這種巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用是PRP組心功能改善的原因之一。

總之,本研究發(fā)現(xiàn)PRP對于急性缺血-再灌注損傷心肌具有保護(hù)作用,這與AMPK的激活和M1/M2型巨噬細(xì)胞極化可能有關(guān)?？紤]到PRP自體來源的安全性,這或許會為心肌缺血-再灌注治療提供新的思路。但本研究也存在一定局限性,由于PRP成分混雜,我們并未具體確定哪些生長因子發(fā)揮了主要作用,以及在AMPK激活之外其他可能存在的心肌保護(hù)通路,這些問題我們都會在接下來進(jìn)一步探索。