劉 娟 ,劉星辰 ,魏寶寶 ,劉 潔 ,王悅?cè)A ,劉 輝

四川大學(xué)1華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科,2出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041；3成都市第六人民醫(yī)院婦科,四川 成都 610051；4成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科,四川 成都610075

卵巢癌具有早期診斷率低,復(fù)發(fā)率高,致死率高的特點(diǎn),因其發(fā)病隱匿,約70%的卵巢癌患者診斷時(shí)已屬晚期(FIGOⅢ～Ⅳ期),目前卵巢癌的治療方案是手術(shù)輔以鉑類(lèi)聯(lián)合紫杉烷類(lèi)藥物化療［1-3］。通常初期行化療的患者均有較好的療效,但在后期仍有大量患者病情會(huì)發(fā)展到終末期,耐藥隨之出現(xiàn)［4］。癌細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗是導(dǎo)致多種化療藥產(chǎn)生耐藥的重要因素,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有助于增加化療藥的效果,而XAF1在這個(gè)過(guò)程中起著重要作用［5-7］。

X-連鎖凋亡抑制蛋白相關(guān)因子(XAF1)是XIAP的內(nèi)源性抑制因子,XIAP是一種強(qiáng)烈的凋亡抑制蛋白,通過(guò)與Caspase3、7、9結(jié)合,阻止終末凋亡反應(yīng)［8］。XAF1在正常細(xì)胞中廣泛表達(dá),然而在惡性腫瘤中包括卵巢癌［9-10］呈低表達(dá)或者缺失表達(dá)［11-13］,主要原因是啟動(dòng)子的高甲基化［14-16］。XAF1低表達(dá)與惡性腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖、Caspase活性增加以及多種凋亡誘導(dǎo)因子,恢復(fù)XAF1的表達(dá)可抑制腫瘤生長(zhǎng),促進(jìn)凋亡發(fā)生并增加腫瘤對(duì)凋亡誘導(dǎo)因子的敏感性［17-18］。此外,XAF1可抑制腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)展,包括誘導(dǎo)G0～G1期［9］、G1期［13］、G2-M期阻滯［19-21］,促進(jìn)有絲分裂災(zāi)難的發(fā)生［19-20］。在臨床組織樣本中,XAF1的表達(dá)量及甲基化狀態(tài)與腫瘤分化程度［10,22-24］、分期［21,23］、耐藥［10,25］、生存期［21,25-26］等相關(guān),XAF1表達(dá)越低腫瘤預(yù)后越差［14,21］。因此,XAF1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

卵巢癌易復(fù)發(fā)并伴隨化療耐藥同時(shí)出現(xiàn),尋找其治療靶點(diǎn)已成為新的研究熱點(diǎn)。曾有學(xué)者檢測(cè)了上皮性卵巢癌中XAF1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)XAF1呈低表達(dá),并與卵巢癌的分化程度及預(yù)后相關(guān),穩(wěn)定過(guò)表達(dá)XAF1后抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖,通過(guò)誘導(dǎo)XIAP失活、caspase-3及細(xì)胞色素c激活促進(jìn)凋亡發(fā)生發(fā)生進(jìn)而增加SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性［10］。進(jìn)一步,ZHAO等通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)增加了卵巢癌細(xì)胞SKOV3 及其順鉑耐藥株SKOV3/DDP中XAF1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)XAF1有較強(qiáng)的抗侵襲作用,通過(guò)抑制XIAP表達(dá)、激活caspase3、9促進(jìn)SKOV3和SKOV3/DDP凋亡,增加了對(duì)順鉑的敏感性,此外XAF1誘導(dǎo)SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞G0/G1阻滯［9］。綜合以上研究說(shuō)明XAF1可能是抑制卵巢癌生長(zhǎng)的重要基因,并且增加了卵巢癌對(duì)順鉑的敏感性。因研究數(shù)目少,且均只用了一種卵巢癌細(xì)胞株即SKOV3進(jìn)行實(shí)驗(yàn),故進(jìn)一步采用不同的卵巢癌細(xì)胞株對(duì)XAF1在卵巢癌中的作用進(jìn)行驗(yàn)證是極其必要的。除此之外,紫杉醇作為卵巢癌化療的重要組成部分,其耐藥已成為影響卵巢癌預(yù)后的主要因素之一,尋找紫杉醇增敏劑對(duì)于提高卵巢癌療效尤其重要。與順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷不同,紫杉醇通過(guò)抑制細(xì)胞有絲分裂,誘導(dǎo)細(xì)胞G2-M期阻滯進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞,而目前XAF1與卵巢癌紫杉醇增敏的相關(guān)研究仍未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用卵巢癌細(xì)胞A2780構(gòu)建XAF1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)模型,研究XAF1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期及紫杉醇敏感性的影響,旨在探究XAF1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供新的更穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?并為卵巢癌患者靶向治療提供新的靶點(diǎn)思路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑儀器

人卵巢癌細(xì)胞株A2780(ECACC catalogue no.93112519)來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室；pcDNA3.1(+)-XAF1重組載體及陰性對(duì)照pcDNA3.1(+)載體構(gòu)建于天津賽爾技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(invitrogen)；RP1640培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×PCR master mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司),主要PCR儀(Bio-Rad)型號(hào)為CFX96；CCK8試劑盒(Biosharp)；流式細(xì)胞儀型號(hào)為Millipore Guava；酶標(biāo)儀型號(hào)為CMax plus。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞株A2780 被培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、青霉素和鏈霉素(1∶100)的RPMI 1640 培養(yǎng)基中,置于37 ℃,5%CO2及90%相對(duì)濕度的細(xì)胞培養(yǎng)孵箱中。細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng),呈上皮細(xì)胞形態(tài),扁平橢圓,每2～3 d傳代1次。

1.3 A2780細(xì)胞的G418篩選最佳濃度確定

pcDNA3.1(+)載體在真核細(xì)胞中表達(dá)neo基因,即帶有遺傳霉素(G418)抗性,首先確定A2780細(xì)胞本身對(duì)G418的耐受程度,即確定最佳篩選濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A2780細(xì)胞接種于24孔板,細(xì)胞密度1.0×105/mL,每孔G418 濃度分別為50、100、200、400、600、800、1000、1100 μg/mL,培養(yǎng)至第6天1100 μg/mL篩選的卵巢癌A2780細(xì)胞全部死亡,因此選擇1100 μg/mL作為最佳篩選濃度。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A2780細(xì)胞接種于6孔板,設(shè)置空白對(duì)照孔,細(xì)胞密度1.5×105/mL,當(dāng)細(xì)胞融合度至70%時(shí),換為無(wú)血清培養(yǎng)基,3 h后,用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將,pcDNA3.1(+)-XAF1 重組載體及陰性對(duì)照pcDNA3.1(+)分別轉(zhuǎn)染進(jìn)A2780細(xì)胞中,6～8 h后換為含血清培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染后72 h 傳代至6 孔板,在含有G4181100 μg/mL培養(yǎng)基中連續(xù)篩選18 d,細(xì)胞克隆集落形成,生長(zhǎng)狀態(tài)良好,驗(yàn)證XAF1的表達(dá)并保種,分別命名為A2780/XAF1和A2780/NC。

1.5 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證XAF1的表達(dá)

復(fù)蘇保種的A2780/XAF1 和A2780/NC,在含有G418(550 μg/mL)的培養(yǎng)基中維持培養(yǎng),傳代2次后,收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,采用TRIzol法提取總RNA,按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在NCBI人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)引物,人XAF1基因上下游引物序列分別為5'-GATGTCTGTCGCAGTGAA-3'和5'-TCTTGGT GCTTTCTTTGA-3',人β-Actin內(nèi)參基因上下游引物序列為5'-GCACCACACCTTCTACAATGAG-3' 和5'-ACAGCCTGGATGGCTACGT-3',將引物、cDNA 及PCR master mix分別加入PCR反應(yīng)管,加入ddH2O至20 μL,反應(yīng)條件:95.0 ℃,30 s 預(yù)變性,熱循環(huán)參數(shù):95.0 ℃,10 s,60.0 ℃,30 s,40個(gè)循環(huán),繪制融解曲線,每組重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以2-ΔCt表示,以對(duì)照組值為1,計(jì)算A2780/XAF1的mRNA相對(duì)表達(dá)量［27］。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖及群體依賴(lài)性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A2780/XAF1(實(shí)驗(yàn)組)和A2780/NC(對(duì)照組)進(jìn)行計(jì)數(shù),每組細(xì)胞分別以每皿50、100、200細(xì)胞的梯度密度分別均勻接種于含培養(yǎng)基的6 cm培養(yǎng)皿中,置于37 ℃,5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周。待培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí),棄去上清,PBS浸洗2次,各加入500 μL,0.1%結(jié)晶紫染液,染色3 h后撤除染液,用PBS洗3遍,晾干后拍照,計(jì)數(shù)肉眼可見(jiàn)的克隆。

1.7 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A2780/XAF1和A2780/NC的增殖活性及對(duì)紫杉醇的敏感性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A2780/XAF1 和A2780/NC,按照2×104/mL的密度接種于96孔板,每孔200 μL,每組復(fù)5孔,分別于細(xì)胞貼壁后1、3 d 加入CCK8,每孔10 μL,37 ℃孵育2 h后,用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處吸光值(A450nm),細(xì)胞增殖活性用吸光值表示。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A2780/XAF1和A2780/NC,按照5×104/mL的密度接種于96孔板中,100 μL/孔。過(guò)夜貼壁后,取出孔板內(nèi)培養(yǎng)液,按0,40,80,160,320 ng/mL的紫杉醇濃度梯度配置培養(yǎng)液,加入96孔板,每組復(fù)5孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,加入CCK8,10 μL/孔,37 ℃孵育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)吸光值A(chǔ)450nm,存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%,半數(shù)抑制濃度即IC50用GraphPad Prism8.3.0計(jì)算。

1.8 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A2780/XAF1和A2780/NC,按照1.5×105/mL的密度接種于6孔板中。過(guò)夜貼壁后,給予不同處理作用24 h后,用不含EDTA的胰酶消化收集各組細(xì)胞(包括漂浮細(xì)胞),PBS沖洗2遍,按照AnnexinVFITC/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒(Cat NO:KGA108)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色15 min后,于流式細(xì)胞儀(型號(hào):Millipore Guava)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A2780/XAF1 和A2780/NC,1.5×105/mL的密度接種于六孔板中,過(guò)夜貼壁后,消化細(xì)胞,PBS沖洗2遍,用75%乙醇固定,凍于-20 ℃過(guò)夜。離心后棄乙醇,PBS洗滌后,按照凋亡周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)量細(xì)胞周期。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0及GraphPad8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用非配對(duì)t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以率表示,無(wú)序多分類(lèi)行列表采用χ2檢驗(yàn),行Bonferroni校正卡方檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)XAF1 的卵巢癌細(xì)胞A2780/XAF1

未轉(zhuǎn)染A2780 空白對(duì)照組與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞同步進(jìn)行G418篩選,第8天,空白對(duì)照組細(xì)胞全部死亡(圖1A),第18天,A2780/NC和A2780/XAF1克隆集落形成(圖1B、C),細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變。qPCR實(shí)驗(yàn)顯示,結(jié)果以2-ΔCt表示,以對(duì)照組值為1,A2780/XAF1細(xì)胞的XAF1mRNA表達(dá)量是A2780/NC的658倍(0.075±0.04951vs0.0001±0.00009,P<0.05)。A2780/NC 和A2780/XAF1均能在500 μg/mL G418中維持生長(zhǎng),且A2780/XAF1 的XAF1mRNA 表達(dá)量增高,穩(wěn)定表達(dá)XAF1的卵巢癌細(xì)胞A2780構(gòu)建成功。

圖1 A2780/NC和A2780/XAF1克隆集落形成Fig.1 Clonal colony formation of A2780/NC and A2780/XAF1 cells(Original magnification:×100).A:A2780 blank control cells.B:A2780/NC cells.C:A2780/XAF1 cells.

2.2 XAF1抑制卵巢癌細(xì)胞A2780的增殖

經(jīng)肉眼計(jì)數(shù),A2780/NC 的克隆形成率分別64%(32/50)、52%(52/100)及56%(112/200),A2780/XAF1的克隆形成率分別為16%(8/50)、20%(40/100)及20.5%(41/200)。計(jì)算兩種細(xì)胞的平均克隆形成率,進(jìn)行差異性檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)A2780/NC與A2780/XAF1的克隆形成能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A,P=0.0016)。

在細(xì)胞接種貼壁后第1、3天,A2780/XAF1的增殖活性均比A2780/NC低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B),進(jìn)一步分別計(jì)算兩種細(xì)胞的增殖速度,發(fā)現(xiàn)A2780/XAF1的增殖速度比A2780/NC低。

圖2 A2780/NC和A2780/XAF1的增殖活性比較Fig.2 Comparison of proliferative activity between A2780/NC and A2780/XAF1 cells.A:Clonal formation rate.B:CCK8 proliferative activity(Optical density at 450 nm).

2.3 XAF1誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞A2780的G2-M期阻滯

我們采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了A2780/NC和A2780/XAF1處于不同細(xì)胞周期的比例。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),A2780/NC和A2780/XAF1的細(xì)胞周期分布差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=150.386,P<0.001),兩兩比較結(jié)果顯示,A2780/NC和A2780/XAF1處于G0～G1期、S期的細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.888,P>0.05)；兩組細(xì)胞在G0～G1 期、G2-M 期的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=135.775,P<0.001),A2780/XAF1 組G2-M 期細(xì)胞百分比更高；兩組細(xì)胞在S 期、G2-M期的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=66.41,P<0.001),A2780/XAF1組G2-M期細(xì)胞百分比更高(圖3)。

圖3 A2780/NC和A2780/XAF1的細(xì)胞周期分布Fig.3 Cell cycle distribution ofA2780/NC(A)andA2780/XAF1(B)cells.

2.4 XAF1不僅單獨(dú)誘發(fā)凋亡發(fā)生,且促進(jìn)無(wú)血清及紫杉醇誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)

在缺乏凋亡誘導(dǎo)因子的作用下,A2780/NC 和A2780/XAF1的總凋亡率分別為3.83%、5.39%,早期凋亡率分別為1.64%、2.97%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；在無(wú)血清刺激作用后,總凋亡率分別為6.36%、8.13%(P<0.001),早期凋亡率分別為3.14%、4.82%(P<0.001)；在紫杉醇80 ng/mL 作用下,總凋亡率分別為6.91%、12.67%(P<0.001),早期凋亡率分別為3.75%、5.95%(P<0.001、圖4)。

圖4 A2780/NC和A2780/XAF1在無(wú)凋亡刺激、無(wú)血清刺激、紫杉醇作用下的凋亡情況Fig.4 Apoptosis of A2780/NC and A2780/XAF1 cells in the absence of apoptosis stimulation,in serum-free culture and following paclitaxel treatment.A:Dual-channel staining of apoptotic A2780/NC cells.B:Dual-channel staining of apoptoticA2780/XAF1 cells.

2.5 XAF1增加了卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。

不同紫杉醇濃度下相對(duì)于無(wú)紫杉醇作用下的卵巢癌細(xì)胞A2780相對(duì)存活率被計(jì)算,結(jié)果顯示,相對(duì)于A2780/NC組,A2780/XAF1細(xì)胞存活率更低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖5)。A2780/NC及A2780/XAF1在紫杉醇作用下的半數(shù)抑制濃度即IC50分別為896.1 ng/mL(95%CI:530.1～2425 ng/mL)和11.66 ng/mL(95%CI:2.54～22.95 ng/mL)。兩因素方差分析結(jié)果顯示,XAF1與紫杉醇聯(lián)合對(duì)于抑制卵巢癌生長(zhǎng)存在協(xié)同作用(P<0.001)。

圖5 XAF1增加卵巢癌對(duì)紫杉醇的敏感性Fig.5 XAF1 increases the sensitivity of ovarian cancer cells to paclitaxel.***P<0.001 vsA2780/NC.

3 討論

本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)及其XAF1重組載體分別轉(zhuǎn)染至A2780,通過(guò)抗性標(biāo)記篩選使得A2780/NC與A2780/XAF1均能在G418中維持生長(zhǎng),經(jīng)qPCR鑒定A2780/XAF1 的XAF1mRNA顯著增高,說(shuō)明模型構(gòu)建成功。該細(xì)胞模型易培養(yǎng),基因表達(dá)穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好,不僅為進(jìn)一步體外研究卵巢癌中XAF1的相關(guān)信號(hào)通路提供了便利,還為研究XAF1在復(fù)雜多變的在體環(huán)境中的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)工具。同時(shí),我們進(jìn)一步檢測(cè)了XAF1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示XAF1明顯抑制了卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng),促進(jìn)其凋亡。這一結(jié)果從功能層次上說(shuō)明XAF1基因在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起到了抑癌基因的作用,與其他研究結(jié)果一致［15］。此外,在細(xì)胞周期方面,本研究結(jié)果顯示XAF1誘導(dǎo)了卵巢癌細(xì)胞G2-M期阻滯。這與部分為胃腺癌細(xì)胞中的研究結(jié)果一致［17,19］。但是,另一項(xiàng)關(guān)于人胚肺成纖維細(xì)胞研究則發(fā)現(xiàn)XAF1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)則產(chǎn)生與p53一樣的G1 期阻滯效應(yīng),采用同樣的研究方法表明XAF1并不影響宮頸癌細(xì)胞的周期分布,有研究分析這一差異是由兩種細(xì)胞的轉(zhuǎn)化程度不同所致,惡性程度更高、生存能力更強(qiáng)的Hela細(xì)胞基因組阻止了XAF1對(duì)細(xì)胞周期分布的影響［13］。在卵巢癌細(xì)胞中,有研究采用重組載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方式提高SKOV3細(xì)胞株中XAF1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)XAF1誘導(dǎo)了SKOV3卵巢癌細(xì)胞G0～G1期細(xì)胞阻滯［9］。不同類(lèi)型細(xì)胞基因組不同,故XAF1對(duì)其細(xì)胞周期的影響有所差異。A2780卵巢癌細(xì)胞來(lái)源于子宮內(nèi)膜樣卵巢腺癌患者,而SKOV3卵巢癌細(xì)胞來(lái)源于漿液性卵巢腺癌,COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)顯示兩種組織型別p53突變頻率分別為73%、51%［28］,p53的突變狀態(tài)可能是XAF1對(duì)細(xì)胞周期分布影響結(jié)果不一致的原因。最后,我們用CCK8實(shí)驗(yàn)探究了XAF1聯(lián)合紫杉醇對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,結(jié)果顯示XAF1提升了卵巢癌對(duì)紫杉醇的敏感性,兩者之間存在協(xié)同作用,是卵巢癌化療和靶向治療的潛在增敏靶點(diǎn)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)XIAP 可誘導(dǎo)耐紫杉醇卵巢癌細(xì)胞凋亡,逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥［29-30］,而XAF1是XIAP的內(nèi)源性抑制因子,故本次研究再次證實(shí)了前期研究結(jié)果。

近年來(lái),因卵巢癌化療耐藥及復(fù)發(fā)的頻繁出現(xiàn),其靶向治療已經(jīng)成為眾多學(xué)者的研究的熱點(diǎn)。卵巢癌凋亡調(diào)節(jié)相關(guān)靶向治療研究包括bcl2家族蛋白和酪氨酸蛋白激酶及凋亡抑制蛋白(IAPs),其中IAPs家族蛋白在抑制內(nèi)源性和外源性凋亡通路均具有重要作用［31］,一項(xiàng)有關(guān)多種惡性腫瘤細(xì)胞(包括卵巢癌細(xì)胞)的研究發(fā)現(xiàn)XAF1蛋白一方面可與除Survivin以外的所有IAPs家族蛋白直接相互作用促進(jìn)凋亡,另一方面通過(guò)激活XIAP-RING結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶促進(jìn)Survivin的降解,表現(xiàn)為促進(jìn)凋亡和有絲分裂災(zāi)難的雙重作用［32］。本研究也存在一定局限性,如未探討XAF1基因的上下游分子變化,未明確其抑癌作用具體機(jī)制,這也將是我們下一階段研究工作的重點(diǎn)。

綜上所述,XAF1基因是卵巢癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵基因,其功能缺失影響相關(guān)上下游基因的表達(dá),進(jìn)而影響卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。XAF1基因過(guò)表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立將有利于研究XAF1基因?qū)β殉舶┑淖饔脵C(jī)制,發(fā)現(xiàn)其上下游基因的一系列變化,對(duì)卵巢癌發(fā)生發(fā)展的具體分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行更深入的探討,并可能為卵巢癌的分子靶向治療提供新的作用靶點(diǎn)。