張智科,袁慧君,張水馨

1中日友好醫(yī)院,北京 100029；2Bascom Palmer眼科中心,美國(guó)33136；3北京市海淀區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,北京100080

呼吸酶鏈復(fù)合物I(complex I)是線粒體內(nèi)膜進(jìn)行氧化磷酸化的重要結(jié)構(gòu),由37個(gè)核基因和7個(gè)線粒體基因編碼。NDUFV1是編碼complex I亞單元的核基因,在不同物種間高度保守,對(duì)酶的活性起關(guān)鍵作用。目前研究發(fā)現(xiàn)NDUFV1基因突變可引起complex I功能異常,是遺傳性腦白質(zhì)病變的重要原因［1］,表現(xiàn)為腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、肌張力減低、錐體束癥狀、Leigh綜合征等神經(jīng)系統(tǒng)異常,并以腦部MRI中腦白質(zhì)異常影像(T2高信號(hào),T1低信號(hào))為特征［2］。本研究報(bào)道一例新型NDUFV1基因突變,表現(xiàn)為兒童時(shí)期發(fā)病的雙眼視神經(jīng)萎縮,MRI無(wú)腦白質(zhì)異常表現(xiàn),并對(duì)該新型基因型、表現(xiàn)型進(jìn)行分析。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集視患兒及其家人的病史及檢查資料,包括父母及姐姐共4例。

1.2 方法

1.2.1 檢查方法 詳細(xì)詢問(wèn)患兒及其家人病史,進(jìn)行全面眼科檢查,包括視力、最佳矯正視力、裂隙燈、眼底照相、光學(xué)相干斷層掃描(OCT)、視野、圖形視覺(jué)誘發(fā)電位(VEP)。完善肌力、肌張力、淺感覺(jué)、深感覺(jué)等神經(jīng)系統(tǒng)檢查,及頭顱核磁(MRI)檢查。

1.2.2 基因檢測(cè) 抽取患兒及父母外周血2 mL,提取DNA,使用二代測(cè)序進(jìn)行基因檢測(cè)。方法如下,采用外顯子捕獲試劑盒(Agilent)定位外顯子區(qū)域,對(duì)這些區(qū)域使用新一代測(cè)序儀(Illumina NextSeq 500,Illumina)進(jìn)行100 bp雙端測(cè)序的二代測(cè)序。所得DNA序列參考人類基因組(GRCh37/UCSC)進(jìn)行組裝和對(duì)齊,并使用分析軟件(Xome Analyzer)進(jìn)行分析。對(duì)所發(fā)現(xiàn)的患兒及親屬的病理性變異進(jìn)行Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 基因致病性分析 比較基因突變位點(diǎn)所編碼氨基酸的保守型(CLC Main Workbench軟件v6.7),使用軟件分析潛在致病性(PolyPhen-2軟件和Mutation Taster軟件)。

1.2.4 蛋白結(jié)構(gòu)分析 依據(jù)所得突變構(gòu)建氨基酸序列,并與野生型氨基酸序列比較。使用SWISS-MODEL在線分析工具(http://swissmodel.expasy.org/)構(gòu)建野生型和突變型蛋白三維結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

13歲女性患兒,近3年雙眼視力下降。既往有注意力缺陷和學(xué)習(xí)障礙。父母和1個(gè)姐姐身體健康。出現(xiàn)癥狀后曾服用輔酶Q、左旋肉堿、α硫辛酸和復(fù)合維生素B?；純荷窠?jīng)可查體未見(jiàn)明顯異常,雙眼視力均為0.05,眼壓右眼12 mmHg,左眼15 mmHg。右眼上方、鼻側(cè)和中央視野缺損,左眼上方和顳上方視野缺損(配合欠佳,右眼光敏度-22.6 db,左眼-8.2 db)。眼底檢查顯示雙眼視盤顳側(cè)蒼白。OCT顯示雙眼視神經(jīng)纖維層(RNFL)缺損及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(RGC)萎縮(右眼114 μm,左眼52 μm)。圖形視覺(jué)誘發(fā)電位(Pattern VEP)振幅降低(圖1)。頭顱MRI顯示雙側(cè)視神經(jīng)變細(xì),未發(fā)現(xiàn)腦白質(zhì)異常的信號(hào)(圖2)。

圖1 患兒眼部檢查結(jié)果Fig.1 Eye examination of the child.A,B:Temporal pallor to both optic nerves;C,D:OCT showed decreased RNFL thickness;E,F:VEP showed low amplitude.RNFL:Retina nerve fiber layer.

圖2 患兒頭顱MRI圖像Fig.2 Brain MRI of the child.T1(A,B)and T2(C,D)of MRI showed no evidence of brain lesion.

治療采用艾地苯醌125 mg 2次/d口服,1月后改為500 mg 3 次/d 口服2 月,患兒感視力稍有提高,右眼0.07,左眼0.06。服藥半年后視力無(wú)明顯變化遂停藥。1年隨訪視力右眼0.07,左眼0.01。

2.2 測(cè)序結(jié)果

基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)患兒存在NDUFV1 基因(NM_007103.3)外顯子1 中出現(xiàn)雜合的移碼突變(c.53_54delTG),T、G兩個(gè)堿基刪除使纈氨酸變?yōu)楸彼?引起新讀碼框在20 位置過(guò)早形成終止編碼(p Val18AlafsX20)。同時(shí)在NDUFV1基因(NM_007103.3)內(nèi)含子8 中存在雜合的點(diǎn)突變(c.1162+4A>C)。未發(fā)現(xiàn)線粒體基因突變。對(duì)父母基因測(cè)序顯示c.53_54delTG來(lái)源于母親,c.1162+4A>C來(lái)源于父親,父母拒絕其姐姐基因檢測(cè)。

2.3 突變和蛋白結(jié)構(gòu)分析

在不同物種間c.53_54delTG突變及c.1162+4A>C所在位點(diǎn)的氨基酸具有高度保守性。使用PolyPhen-2和Mutation Taster分析提示上述兩種為致病突變。

對(duì)NDUFV1 蛋白三維結(jié)構(gòu)分析表明,p Val18AlafsX20引起NDUFV1第18個(gè)氨基酸之后的氨基酸序列缺失,失去了應(yīng)有的黃素單核苷酸(FMN)和鐵-硫簇結(jié)構(gòu),與野生型相比發(fā)生明顯變化(圖3)。

圖3 野生型(A)和突變(B)NDUFV1的三維結(jié)構(gòu)Fig.3 3D structure of the wild-type (A) and mutant (B) NDUFV1.Mutant NDUFV1 lost almost all main structure including flavin mononucleotide(white arrow)and Fe-S cluster(black arrow).

3 討論

線粒體complex I是線粒體呼吸酶鏈的重要結(jié)構(gòu),將電子從NADH轉(zhuǎn)移到輔酶Q。NDUFV1基因突變的致病性與complex I功能異常有關(guān),主要影響下面三種功能:(1)結(jié)合FMN及NADH；(2)將電子轉(zhuǎn)移到鐵-硫簇；(3)維持complex I各亞單元結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［3］。

NDUFV1基因突變多引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,包括肌張力減低、錐體束功能異常、肌陣攣癲癇、癲癇發(fā)作、共濟(jì)失調(diào)等［4］,并認(rèn)為是Leigh綜合征的一個(gè)重要致病基因,在MRI上呈現(xiàn)腦白質(zhì)病變表現(xiàn)［5-7］。Vilain等［8］發(fā)現(xiàn)NDUFV1基因突變個(gè)體中骨骼肌組織complex I功能明顯低于對(duì)照組,肝臟組織則功能正常,表明骨骼肌癥狀與肌細(xì)胞中complex I功能異常有關(guān)。本研究中的NDUFV1未引起明顯中樞神經(jīng)系統(tǒng)及骨骼肌相關(guān)癥狀,在MRI上未出現(xiàn)腦白質(zhì)病變征象,呈現(xiàn)不同的表現(xiàn)型。既往報(bào)道突變多為錯(cuò)義突變［8-9］,而本研究發(fā)現(xiàn)突變?yōu)橐拼a突變,表現(xiàn)型不同可能跟突變類型不同有關(guān)。既往研究也發(fā)現(xiàn)NDUFV1基因突變除表現(xiàn)為L(zhǎng)eigh綜合征的嚴(yán)重全身癥狀外,也可表現(xiàn)為學(xué)習(xí)障礙、語(yǔ)言發(fā)育遲緩等輕度癥狀,呈現(xiàn)多種表現(xiàn)型［7］,表明基因型和表現(xiàn)型之間具有復(fù)雜的關(guān)系。

既往NDUFV1基因突變多報(bào)道為錯(cuò)義突變,造成FMN結(jié)合位點(diǎn)或鐵-硫簇結(jié)構(gòu)異常,影響complex I功能［10］,也可引起complex I 的亞單元組裝缺陷,造成complex I 數(shù)量減少［11］。而本研究所發(fā)現(xiàn)的新型NDUFV1基因移碼突變所引起的蛋白功能異常則不同,表現(xiàn)為NDUFV1關(guān)鍵性的FMN和鐵-硫簇的功能均缺失,提示新的致病機(jī)制。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)了NDUFV1的另一個(gè)內(nèi)含子的突變。Benit等［12］曾報(bào)道一例癲癇、運(yùn)動(dòng)異常的嬰兒具有NDUFV1 外顯子5 突變(c.640G>A)、內(nèi)含子8 突變(c.1192+4A>C),內(nèi)含子8突變與本研究發(fā)現(xiàn)的c.1162+4A>C位點(diǎn)接近。Benit等的病例與本研究具有相似的特點(diǎn),患兒分別從父母遺傳兩種不同NDUFV1基因突變,引起了complex I功能異常的癥狀,而父母未發(fā)病。內(nèi)含子8點(diǎn)突變可引其基因剪切異常,導(dǎo)致外顯子8表達(dá)異常及RNA的不穩(wěn)定,引起complex I功能異常［12］。且該突變位點(diǎn)在各物種之間高度保守,因此,認(rèn)為本研究發(fā)現(xiàn)的c.1162+4A>C是與表型相關(guān)的病理性突變。

既往沒(méi)有表現(xiàn)為視神經(jīng)萎縮的NDUFV1突變的報(bào)道。該患兒主要表現(xiàn)是雙眼進(jìn)行性的視神經(jīng)萎縮,應(yīng)與視神經(jīng)炎鑒別。該患兒沒(méi)有急性視力下降病史,進(jìn)行了詳細(xì)的神經(jīng)查體,無(wú)肌力、肌張力、感覺(jué)異常、共濟(jì)失調(diào)等其他神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn),腦脊液檢查無(wú)明顯異常,與視神經(jīng)炎表現(xiàn)不符?；純篗RI無(wú)腦積水表現(xiàn),腦脊液壓力正常,排除高顱壓引起視神經(jīng)萎縮。患兒無(wú)外傷、腦部腫瘤、視網(wǎng)膜色素變性等可引起繼發(fā)性視神經(jīng)萎縮的原發(fā)疾病。排除其他原因視神經(jīng)萎縮后考慮為遺傳性視神經(jīng)疾病。最常見(jiàn)的遺傳性視神經(jīng)疾病是Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON),是線粒體基因突變引起complex I功能異常引發(fā)的視神經(jīng)表現(xiàn)為主的疾病。雖然該患兒表現(xiàn)型接近LHON,但該患兒并未發(fā)現(xiàn)線粒體基因的異常,反而在全外顯子測(cè)序中發(fā)現(xiàn)了與complex I相關(guān)的核基因,即NDUFV1的異常。對(duì)NDUFV1基因的進(jìn)一步研究有助于揭示complex I異常與視神經(jīng)萎縮間的病生理機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)存在線粒體基因ND1突變及NDUFV1 基因突變共同存在的家系,引起complex I功能和數(shù)量的改變,提示線粒體基因ND1與NDUFV1共同作用引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀［11］。

目前缺乏NDUFV1基因突變相關(guān)疾病的有效治療方式。既往報(bào)道該基因突變患兒多于出生數(shù)月至3歲早夭,預(yù)后較差,目前治療原理上是通過(guò)補(bǔ)充呼吸酶鏈必不可少的核黃素,期望改善complex I 功能［3］。Benit等［12］報(bào)道使用補(bǔ)充B族維生素治療取得了一定的效果,也有報(bào)道采用生酮飲食改善了癥狀［13］。本研究通過(guò)補(bǔ)充艾地苯醌在初期一定程度改善了癥狀,對(duì)該類疾病的治療有一定借鑒意義。

綜上所述,本研究報(bào)道了一例新NDUFV1基因突變,表現(xiàn)為兒童發(fā)病的視神經(jīng)萎縮,其表現(xiàn)型與既往NDUFV1基因突變不同。該NDUFV1基因突變引起complex I 亞單元蛋白結(jié)構(gòu)異常,但該異常引起complex I功能的變化需進(jìn)一步研究,并且有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其引起視神經(jīng)萎縮卻不引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常的機(jī)制。