陳志騰

(江蘇科技大學(xué) 糧食學(xué)院，鎮(zhèn)江 212100)

襀翅目(Plecoptera)昆蟲，俗名石蠅(stonefly)，是一類重要的半變態(tài)類水生昆蟲，其稚蟲常棲息于清澈的流水中，老熟稚蟲漂浮至水面或爬上岸邊羽化成蟲. 該目昆蟲由于對水質(zhì)變化極為敏感，因此是水質(zhì)監(jiān)測的重要生物指標(biāo). 近年來，由于我國城市化進(jìn)程顯著加快，各流域的水質(zhì)受到了不同程度的影響. 大量的襀翅目昆蟲正在快速滅絕，其中甚至包括尚未被發(fā)現(xiàn)和描述的新物種. 由于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法耗時、耗力，且需要專業(yè)的分類學(xué)技能，所以迫切需要尋找一種快速鑒定的方法，來協(xié)助水質(zhì)監(jiān)測工作和生物多樣性的調(diào)查.

DNA條形碼技術(shù)是近十幾年來逐漸發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)，該技術(shù)通過線粒體基因組中COI基因的部分片段來實(shí)現(xiàn)物種的快速鑒定[1]. 目前，國外已經(jīng)有研究借助DNA條形碼技術(shù)對襀翅目昆蟲進(jìn)行快速鑒定、不同生長期的匹配，以及種群遺傳學(xué)方面的研究[2-4]. 同時，也有研究建立了當(dāng)?shù)氐囊H翅目DNA條形碼數(shù)據(jù)庫[5-7]. 目前已知的中國襀翅目DNA條形碼序列大多來源于線粒體基因組數(shù)據(jù)，僅有少數(shù)來源于將形態(tài)學(xué)與基因結(jié)合的分類學(xué)研究[8-9].但是，中國襀翅目的DNA條形碼尚無專門研究，這個空缺阻礙了該類群的深入研究.

為了對中國襀翅目的遺傳特征有更進(jìn)一步的了解，文中統(tǒng)計了中國襀翅目DNA條形碼數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法分析了DNA數(shù)據(jù)的遺傳特征，并基于DNA條形碼數(shù)據(jù)進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，驗(yàn)證了這些數(shù)據(jù)在物種劃分和親緣關(guān)系重建方面的作用，為中國襀翅目快速鑒定和遺傳多樣性研究提供了參考.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 中國襀翅目DNA條形碼數(shù)據(jù)獲取

以GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫和BOLD條形碼數(shù)據(jù)庫(http://www.boldsystems.org/)進(jìn)行在線襀翅目COI基因搜索，發(fā)現(xiàn)中國襀翅目36個物種已經(jīng)測序，但是僅有28個物種的42條COI基因序列已公開(表1). 將該42條基因序列以.fasta文件格式下載并存儲.

1.2 DNA條形碼分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用ClustalX 1.83程序?qū)Λ@取的DNA序列進(jìn)行多序列比對分析，序列比對結(jié)果通過Mega 6.0程序進(jìn)行核苷酸成分分析、位點(diǎn)分析和基于K2P模型的遺傳距離分析. 使用DAMBE 4.2.13程序?qū)π蛄兄泻塑账崽鎿Q(轉(zhuǎn)換/顛換)的飽和性進(jìn)行分析. 使用Mega 6.0程序的鄰接法 (Neighbor-joining NJ) 構(gòu)建中國襀翅目DNA條形碼的系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置參數(shù)如下：自舉值為1000，模型為kimura-2-parameter，堿基替換模型為transitions+transversions，位點(diǎn)進(jìn)化速率為uniform rates，空缺數(shù)據(jù)刪除方法為pairwise deletion. Mega 6.0程序?qū)С龅腘ewick格式樹文件通過FigTree 1.4.3 程序進(jìn)行可視化分析，自展分析的各節(jié)點(diǎn)支持率標(biāo)記在進(jìn)化樹節(jié)點(diǎn)上.

2 結(jié)果與討論

2.1 中國襀翅目DNA條形碼數(shù)據(jù)統(tǒng)計

文中獲取的DNA條形碼序列來源于28種、26屬、8科(表1)，主要集中于襀科、叉襀科和卷襀科. 而大襀科、帶襀科的DNA條形碼仍然空缺. 因此，這些條形碼的數(shù)量與各科的物種數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系，物種數(shù)較多的科，往往具有較多DNA條形碼數(shù)據(jù)，而那些物種稀少的科，則具有較少的數(shù)據(jù)(圖1).

圖1 中國襀翅目各科DNA條形碼已知物種數(shù)

2.2 中國襀翅目DNA條形碼特征

根據(jù)ClustalX 1.83程序比對分析，DNA條形碼序列的重疊長度為619 bp，足夠用于物種的快速鑒定(圖2). 經(jīng)過計算，所有序列都明顯偏向于使用A堿基和T堿基，表現(xiàn)出偏高的A+T含量：平均A+T含量為60.0%，最高A+T含量為64.8%，最低為53.5% (表2).

表2 中國襀翅目DNA條形碼的堿基成分

圖2 中國襀翅目DNA條形碼序列比對

在這些條形碼序列中，共檢測到360個未發(fā)生堿基變異的保守位點(diǎn)(Conserved sites)，占重疊序列的58.2%. 此外，還檢測到259個存在2種或2種以上堿基變異的變異位點(diǎn)(Variable sites)，占重疊序列的41.8%. 這些條形碼的核苷酸序列可以轉(zhuǎn)換成206個氨基酸序列，其中絲氨酸Ser出現(xiàn)頻率最高，而谷氨酸Glu出現(xiàn)頻率最低.

DAMBE程序的核苷酸替代飽和性分析結(jié)果中(表3)，ISS

表3 DNA序列替換飽和度檢驗(yàn)

2.3 遺傳距離分析

基于Kimura-2-parameter (K2P)模型和COI基因序列，28種襀翅目昆蟲的遺傳距離經(jīng)計算如圖3. 在28種襀翅目昆蟲內(nèi)，遺傳距離變化較大，最大為30%. 對于同一物種來說，種內(nèi)不同個體之間的遺傳距離較低，最小為0，最大為4%. 對于同屬內(nèi)的不同物種來說，遺傳距離變化較大，最小為0，最大為24%.

這兩個分類水平的遺傳距離范圍有所重疊，說明常用的遺傳距離閾值2%不完全適用于襀翅目所有類群. 應(yīng)當(dāng)進(jìn)行更多的采樣和測序，對不同分類階元的遺傳距離閾值進(jìn)行分析，從而選擇出最優(yōu)的一系列閾值用于以后的DNA條形碼研究.

2.4 DNA條形碼系統(tǒng)進(jìn)化樹

在基于DNA條形碼序列構(gòu)建的鄰接樹中(圖4)，翠華山擬卷襀(Paraleuctracuihuashana)和東方擬卷襀(Paraleuctraorientalis)兩個具有多于1條序列的物種的單系性得到了強(qiáng)烈支持，且節(jié)點(diǎn)支持率較高. 擬卷襀屬(Paraleuctra)、諾襀屬(Rhopalopsole)和鉤襀屬(Kamimuria)均分別聚為單系分支，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致. 但是球尾叉襀屬(Sphaeronemoura)、黑襀屬(Capnia)、印叉襀屬(Indonemoura)、叉襀屬(Nemoura)和同襀屬(Isoperla)的單系性未得到支持. 這些單系性未被支持的類群由于可用的DNA條形碼序列有限，無法與相近的類群區(qū)分開. 同時，在線數(shù)據(jù)庫中也可能存在錯誤鑒定的種類，測序產(chǎn)生的錯誤序列對系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)造成了不良影響. 因此，需要在以后的研究中通過大量測序相同物種的不同個體，經(jīng)過序列比對分析保留序列相似的物種，而排除那些具有明顯差異的序列. 在更高的科級水平，DNA條形碼序列由于堿基數(shù)量有限，堿基所代表的遺傳信息也很局限，無法將各科有效區(qū)分.

圖4 基于DNA條形碼構(gòu)建的中國襀翅目鄰接樹

3 結(jié)論

研究表明，基因水平的鑒定與分析對生物的系統(tǒng)發(fā)育和生物學(xué)功能研究具有重要的作用[11-12].DNA條形碼技術(shù)在中國襀翅目研究中的前景十分廣泛，不僅可以用于物種的快速鑒定，還能促進(jìn)種群遺傳學(xué)、生物地理學(xué)以及生物多樣性等方面的研究. 文中統(tǒng)計和分析了中國襀翅目DNA條形碼的序列特征，并驗(yàn)證了該技術(shù)對物種區(qū)分的有效性. 在未來的研究中需要對中國襀翅目各科、屬、種選取大量樣本進(jìn)行DNA條形碼測序，并分析不同分類階元的DNA條形碼劃分閾值，構(gòu)建中國襀翅目DNA條形碼數(shù)據(jù)庫.