溫鈺蓉，尹姣姣，田文霞，馬海利，高榮琨，張 鼎，李 楨，喬夢(mèng)麗，王 穎，寧官保

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

防御素是一類主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞的抗菌肽家族，它在天然免疫和天然免疫之外的生物學(xué)功能、結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系、作用機(jī)制和治療潛力一直是人們感興趣的研究課題。一個(gè)防御素分子中，含有6～8個(gè)半胱氨酸殘基，其中形成3～4對(duì)分子內(nèi)的二硫鍵。根據(jù)半胱氨酸殘留物的序列同源性和連通性的不同，故有植物防御素、昆蟲防御素、α-防御素、β-防御素和θ-防御素之分[1]。目前為止，共發(fā)現(xiàn)14種防御素。近年來(lái)，關(guān)于這14種雞防御素及其應(yīng)用一直為研究熱點(diǎn)，但防御素存在以下問(wèn)題：（1）分子小，易被蛋白酶降解；（2）作為小分子物質(zhì)，其分離純化較困難；（3）禽類動(dòng)物體內(nèi)含量較少，化學(xué)合成成本較高[2-3]，而利用基因工程技術(shù)，可使其在微生物體內(nèi)直接表達(dá)，提高生產(chǎn)效率，降低成本；（4）與傳統(tǒng)的抗生素相比，某些防御素的活性尚不理想，改造設(shè)計(jì)防御素分子是提高其活性的有效途徑，這就需要進(jìn)一步改良防御素。針對(duì)防御素天然含量低的問(wèn)題，基因串聯(lián)表達(dá)技術(shù)能夠在基因?qū)用嬗行Ы鉀Q此問(wèn)題[4-7]，此技術(shù)有利于小分子肽的表達(dá)和防御素的工業(yè)化產(chǎn)出。防御素屬于抗菌肽中的一類陽(yáng)離子多肽，對(duì)動(dòng)物體本身有著天然免疫作用[8-9]。雞β-防御素最早由HARWIG等[10]從雞嗜中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)得到，并對(duì)發(fā)現(xiàn)的防御素分別命名為Gal-1、Gal-1α、Gal-2、Gal-3。

雞體內(nèi)分布有14種β-防御素[11-13]，若能解決其天然含量較低的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)在體外可大量表達(dá)的愿望，不僅能夠使因抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌不斷產(chǎn)生耐藥性不再是問(wèn)題，而且對(duì)于社會(huì)來(lái)說(shuō)增添了很大的效益。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明，在特定工程菌內(nèi)基因工程技術(shù)可生產(chǎn)大量天然防御素[14-18]。基因工程技術(shù)先進(jìn)，易于操作，能提高蛋白表達(dá)量，使防御素表達(dá)效率較高，并且成本較低。王婷婷等[19]在對(duì)抗菌肽基因同向串聯(lián)表達(dá)載體的研究中，探討了一種構(gòu)建多拷貝基因串聯(lián)體的方法。對(duì)于小分子多肽等單拷貝蛋白表達(dá)量不高的基因，基因工程技術(shù)可以有效解決此問(wèn)題。基因串聯(lián)表達(dá)技術(shù)采用串聯(lián)小分子多肽基因序列的方式構(gòu)建重組表達(dá)載體，提高了防御素的分子質(zhì)量并且增加了蛋白表達(dá)量，故本試驗(yàn)采用串聯(lián)表達(dá)技術(shù)提升雞β-防御素5（AvBD-5，又稱Gal-5）蛋白表達(dá)量，并分析其生物學(xué)活性。

本試驗(yàn)通過(guò)串聯(lián)表達(dá)的方法得到2×Gal-5基因，并將目的基因與pET-28a表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化到BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，經(jīng)鑒定得到pET-28a-2×Gal-5蛋白，并進(jìn)行生物學(xué)活性檢測(cè)，旨在為后續(xù)動(dòng)物試驗(yàn)及家禽疾病的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 基因工程菌BL21 基因工程菌BL21由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院生物制品實(shí)驗(yàn)室保存，pET-28a載體質(zhì)粒系統(tǒng)為全式金公司產(chǎn)品。

1.1.2 酶類及其他試劑 限制性內(nèi)切酶Eco R I、Nde I和T4L連接酶均購(gòu)自Takara公司；PR1900蛋白Marker、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自北京索萊寶科技公司；質(zhì)粒小提（中量）試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；Anti-6×His抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)與合成 采用DNAstar軟件設(shè)計(jì)的引物送至上海生工生物工程股份有限公司合成。引物為Gal-5-1：GACACGACACCATATGCG CCCTCTGCCACTTGATTGTG；Gal-5-2：GTGTCCTC GAGTTACCTTTACCAGCGAGAACCCCA。

本試驗(yàn)以2×Gal-5-1、2×Gal-5-2為上下游引物擴(kuò)增成熟肽段，引物中下劃線部分分別為加入的限制性酶切位點(diǎn)Nde I和Eco R I，方便表達(dá)載體的構(gòu)建。

1.2.2 2 ×Gal-5串聯(lián)基因的擴(kuò)增 按照NCBI上雞AvBD-5的cDNA編碼區(qū)序列（登錄號(hào)：AY621307），優(yōu)化序列后將其進(jìn)行2次串聯(lián)的基因序列為：CATATGCGCGGGTTGCCCCAAGATTGCGAACGTC GCGGTGGCTTCTGCTCACATAAATCGTGTCCGCCT GGAATCGGGCGCATCGGATTATGTAGCAAAGAGG ACTTTTGTTGTCGCTCCCGCTGGTATTCTGGAGGC GGAGGTAGCGGTGGTGGCGGATCTCGCGGGCTTC CACAGGACTGTGAGCGCCGTGGAGGGTTTTGTAG TCATAAGTCATGTCCTCCCGGTATCGGACGTATCG GCCTTTGTTCGAAAGAGGATTTTTGCTGTCGCAGC CGTTGGTATTCATAACTCGAG。上述序列中下劃線為Nde I和Eco R I酶切位點(diǎn)，交由上海生工有限公司合成基因序列。以2×Gal-5序列DNA為模板，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為297 bp，反應(yīng)體系為：10×PFU緩沖液和dNTP各5μL，模板1μL，上游引物Gal-5-1、下游引物Gal-5-2各0.5μL，PFU 0.4μL，加水至50μL。擴(kuò)增條件：95℃，3 min；95℃，22 s，55℃，22 s，72℃，30 s，24個(gè)循環(huán)；72℃，5 min。

1.2.3 pET-28a-2×Gal-5表達(dá)載體的構(gòu)建 按照質(zhì)粒小提（中量）試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行pET-28a質(zhì)粒的提取后，采用限制性內(nèi)切酶Nde I、Eco R I對(duì)純化回收后的PCR產(chǎn)物和pET-28a載體進(jìn)行雙酶切。以2×Gal-5目的基因和pET-28a載體的摩爾比為3∶1進(jìn)行連接，通過(guò)菌液PCR和雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，并送至上海生工測(cè)定DNA序列。測(cè)序正確后將連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞BL21中。

1.2.4 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 使用一次性接種環(huán)挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落于5 mL液體LB培養(yǎng)基（含30μg/mL卡那霉素）中，37℃，220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜；之后吸取1 mL菌液加入10 mL LB液體培養(yǎng)基（含30μg/mL卡那霉素）中，并在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)；當(dāng)OD600值達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG，在20、37℃的環(huán)境下各誘導(dǎo)12 h。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 在誘導(dǎo)表達(dá)12 h后，以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min后將上清棄掉，取沉淀用PBS重懸后進(jìn)行超聲波破碎，之后以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取不同環(huán)境下誘導(dǎo)管中的上清和沉淀，加入4×Protein Loading Buffer上樣緩沖液后沸水中放置10 min；將處理過(guò)的樣品做SDS-PAGE蛋白電泳，未加IPTG誘導(dǎo)的菌液作為陰性對(duì)照。

1.2.6 2 ×Gal-5重組蛋白的純化 鑒定重組蛋白表達(dá)主要以包涵體形式存在，將包涵體洗滌液Ⅰ重懸菌體沉淀，收集懸浮液于預(yù)冷的燒杯中，4℃攪拌洗滌2 h后10000 r/min離心20 min，用洗滌液Ⅱ、Ⅲ和包涵體溶解液重懸，操作同洗滌液Ⅰ，待溶解液溶解2 h之后收集裂解液上清即為重組蛋白釋放液。

1.2.7 原核重組蛋白的復(fù)性 將純化后的蛋白置于透析袋中復(fù)性。透析液為尿素，尿素濃度依次為6、4、2、0 mol/L的PBS溶液，每隔2 h換液一次，最后再用PBS透析過(guò)夜。將所得到的蛋白液收集，測(cè)定蛋白濃度，-80℃冰箱保存。

1.2.8 抑菌試驗(yàn) 取出純化后的蛋白5 mL（質(zhì)量濃度為0.1μg/μL），1 mL用PBS稀釋至0.05μg/μL，4 mL蛋白濃縮至質(zhì)量濃度為0.2μg/μL；將大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌4種菌均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿上，垂直放置牛津杯在平板表面，并向其加入200μL純化好的蛋白，12 h后觀察抗菌情況，抗菌結(jié)果應(yīng)同PBS組作對(duì)照，若隨著蛋白濃度的提高，抑菌圈逐漸擴(kuò)大，說(shuō)明抗菌情況較好。

2 結(jié)果與分析

2.1 2×Gal-5串聯(lián)基因的擴(kuò)增結(jié)果

以Gal-5-1和Gal-5-2為引物，2×Gal-5為模板，擴(kuò)增產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果在300 bp處出現(xiàn)1條預(yù)期大小的條帶（圖1），表明已成功擴(kuò)增出2×Gal-5成熟肽基因片段。

2.2 重組表達(dá)載體pET-28a-2×Gal-5鑒定結(jié)果

將2×Gal-5插入到原核表達(dá)載體pET-28a中，獲得重組質(zhì)粒pET-28a-2×Gal-5，經(jīng)Nde I和Eco R I雙酶切鑒定，目的基因2×Gal-5已正確插入到pET-28a的Nde I/Eco R I位點(diǎn)（圖2）。測(cè)序結(jié)果證實(shí)目的基因2×Gal-5成功重組到pET-28a表達(dá)載體中。

2.3 重組2×Gal-5蛋白表達(dá)結(jié)果

經(jīng)SDS-PAGE分析，重組質(zhì)粒pET-28a-2×Gal-5表達(dá)出了約為12 ku的2×Gal-5重組蛋白，與預(yù)期相符，且在20、37℃環(huán)境條件下誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，20℃時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物更多（圖3）。Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)蛋白以包涵體形式存在，并且20℃環(huán)境下誘導(dǎo)出的蛋白含量比37℃環(huán)境下高（圖4）。

2.4 重組2×Gal-5蛋白的純化結(jié)果與分析

融合蛋白經(jīng)過(guò)純化，SDS-PAGE和Western Blot凝膠電泳分析，在相應(yīng)位置均出現(xiàn)明顯條帶，表明融合蛋白純化成功（圖5、6）。

2.5 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

抑菌結(jié)果顯示（圖7），不同濃度2×Gal-5蛋白對(duì)大腸桿菌抑菌時(shí)，抑菌圈直徑的平均值分別為0、7.50、15.50、22.00mm。

3 結(jié)論與討論

目前Gal-5、Gal-9、Gal-12、Gal-13在大腸桿菌中表達(dá)出的蛋白均以包涵體形式出現(xiàn)[20-24]。本試驗(yàn)研究的雞β-防御素5常規(guī)表達(dá)量較低，采用串聯(lián)表達(dá)技術(shù)將2×Gal-5串聯(lián)其基因序列，增加其分子質(zhì)量后對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)，可形成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的蛋白[18]，試驗(yàn)在20、37℃環(huán)境下分別誘導(dǎo)，經(jīng)檢測(cè)在20℃環(huán)境下誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)量有一定的提高，若試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化應(yīng)該會(huì)達(dá)到更理想的效果。純化重組蛋白后測(cè)定其蛋白質(zhì)量濃度為0.1μg/μL，后進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)的初步摸索，表現(xiàn)出雞β-防御素5對(duì)4種指示菌的抑菌活性[25]。同PBS組對(duì)比，隨著蛋白濃度的成倍增加，抑菌范圍不斷擴(kuò)大，說(shuō)明該蛋白對(duì)大腸桿菌的抗菌效果明顯。

基因串聯(lián)表達(dá)技術(shù)是基因工程技術(shù)中最基本的一項(xiàng)技術(shù)，有其自身特殊性所在，在表達(dá)小分子肽時(shí)具有非常突出的優(yōu)勢(shì)，能夠克服小分子肽在體外表達(dá)產(chǎn)量低的問(wèn)題，在蛋白質(zhì)表達(dá)中發(fā)揮了重要的作用，目前已被廣泛研究和應(yīng)用[26]。本試驗(yàn)采用串聯(lián)表達(dá)技術(shù)串聯(lián)2個(gè)小肽基因序列，提高了分子質(zhì)量并且增加了蛋白表達(dá)量。在基因序列的串聯(lián)方式的選擇上，反向串聯(lián)會(huì)破壞其重組表達(dá)載體的穩(wěn)定性，降低其蛋白表達(dá)量，所以，在本試驗(yàn)中為避免該問(wèn)題，采用同向串聯(lián)的方式[27-29]串聯(lián)AvBD-5目的基因，能夠有效提升2×Gal-5表達(dá)量及穩(wěn)定性。

綜上所述，很多利用大腸桿菌表達(dá)的抗菌肽，如2×β-防御素2和3×β-防御素130，在前人試驗(yàn)進(jìn)展中將其培養(yǎng)條件不斷摸索，不僅成功表達(dá)蛋白而且將其產(chǎn)量顯著提升，達(dá)到了串聯(lián)表達(dá)的目的。而且利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)其防御素，使其表達(dá)效率增高，成本降低，表明了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)十分適合生產(chǎn)AvBD-5。與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比，基因連接表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌后誘導(dǎo)表達(dá)使蛋白表達(dá)效率可以高出好幾倍，其生長(zhǎng)速度較快以及培養(yǎng)時(shí)所需的成本低，同時(shí)獲得蛋白活性較高，產(chǎn)量大，穩(wěn)定性好[29-33]。根據(jù)大腸桿菌表達(dá)雞AvBD-5抗菌活性試驗(yàn)可以得出，大腸桿菌對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌活性較強(qiáng)，說(shuō)明了利用串聯(lián)表達(dá)技術(shù)可以有效提高防御素的蛋白活性，使得雞防御素在預(yù)防和治療細(xì)菌感染具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步探討。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建可串聯(lián)表達(dá)Gal-5且具有生物學(xué)活性的大腸桿菌原核表達(dá)載體。