郭俊佩，劉 璇，韓阜志，高建華，史宗勇

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

Cry蛋白是應(yīng)用最廣泛的Bt殺蟲蛋白，對(duì)雙翅目、鞘翅目和膜翅目等害蟲具有特異、高效的毒殺作用[1]，Cry蛋白的結(jié)構(gòu)和殺蟲機(jī)制已被廣泛研究[2]。Cry殺蟲蛋白主要以伴孢晶體的形式存在于蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）細(xì)胞中[3]，其N端含有3個(gè)與殺蟲相關(guān)的結(jié)構(gòu)域[4-7]，為Cry蛋白的主要功能域，僅有這3個(gè)結(jié)構(gòu)域的Cry蛋白的分子質(zhì)量約為65 ku[8-9]；另外，部分Cry蛋白C端還有一段長肽，主要幫助Cry蛋白形成晶體結(jié)構(gòu)，這類蛋白的分子質(zhì)量大小約為135 ku。對(duì)于分子質(zhì)量約65 ku的Cry蛋白而言，形成伴孢晶體需要其他蛋白的幫助，如Cry2Aa蛋白需要在cry2Aa操縱子表達(dá)的Orf2蛋白（29.4 ku）幫助下才能形成伴孢晶體[10]；cry11A操縱子中orf3基因編碼一個(gè)20 ku的蛋白質(zhì)，可充當(dāng)分子伴侶，輔助Cry11A形成伴孢晶體[11]。

Cry1I類蛋白結(jié)構(gòu)較為特殊，這類蛋白無C端長肽，在Bt細(xì)胞中表達(dá)后不形成伴孢晶體[12]，由N端信號(hào)肽介導(dǎo)釋放到胞外[8，13]。原核細(xì)胞中，常見分泌信號(hào)肽一般分為3個(gè)部分，即N區(qū)、H區(qū)和C區(qū)[14-15]。其中，N區(qū)由帶正電荷氨基酸組成，可與脂質(zhì)雙層帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)相互作用，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)的有效轉(zhuǎn)運(yùn)；H區(qū)是中性氨基酸組成的疏水功能區(qū)，決定信號(hào)肽的構(gòu)象及其對(duì)細(xì)胞膜的取向、信號(hào)肽的裂解以及影響蛋白加工和轉(zhuǎn)運(yùn)效率；C區(qū)由多個(gè)極性氨基酸組成且含有信號(hào)肽酶作用位點(diǎn)，其酶切作用位點(diǎn)較保守，切割效率決定蛋白質(zhì)的分泌水平。

Cry1類蛋白通常只對(duì)某一種昆蟲有特異殺蟲活性，而Cry1I分泌型蛋白對(duì)大多數(shù)鱗翅目和鞘翅目昆蟲均有殺蟲活性，作為廣譜殺蟲蛋白具有良好的應(yīng)用潛力[16]。如Cry1Ia蛋白能夠毒害鱗翅目和鞘翅目昆蟲[17]，Cry1Ie蛋白對(duì)亞洲玉米螟[18]、小菜蛾[19]和棉鈴蟲[20]等具有較高的殺蟲活性。此外，KOSTICHKA等[12]、SCHNEPF等[21]分析認(rèn)為，Cry1Ia蛋白的N端信號(hào)肽Iasp中第1～10個(gè)氨基酸為N區(qū)，第11～16個(gè)氨基酸為H區(qū)，剩余29個(gè)氨基酸為C區(qū)。GAO等[22]將Iasp融合到綠色熒光蛋白eGFP的N端形成融合熒光蛋白IeGFP，其表達(dá)量顯著高于eGFP，繼而增強(qiáng)了宿主細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，說明信號(hào)肽融合是基因表達(dá)量增強(qiáng)的原因之一，可見Iasp功能非常重要。

為深入了解Iasp完整性對(duì)Cry1Ia自身表達(dá)量的影響，本研究將Iasp的N端分別截取5、10、13、16、24、32、44、73個(gè)氨基酸，構(gòu)建一系列Iasp缺失突變體，分析N端氨基酸不同程度缺失對(duì)Cry1Ia蛋白原核表達(dá)的影響，旨在為解析Iasp功能奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為大腸桿菌（Escherichia coli）TG1菌株及BL21 Star（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。

所用試劑為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量1 kb Plus DNA Ladder，購自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；AxyGEN質(zhì)粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ/SacⅠ、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量PageRuler Prestained Protein Ladder，均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 在含有50μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線接種Tp304-1Ia[23]菌株的菌液，37℃條件下培養(yǎng)10 h。將單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基（含有50μg/mL的氨芐青霉素），37℃200 r/min培養(yǎng)10 h，提取質(zhì)粒DNA。

表1 研究所使用的引物

表2 研究所使用的質(zhì)粒

采用SnapGene DNA軟件設(shè)計(jì)引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為Green mix 12.5μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板0.5μL，加ddH2O至總反應(yīng)體積25μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸150 s，35次循環(huán)；最后72℃延伸5 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TA克?。╬MD19），測(cè)序正確后，用BamHⅠ和SacⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，回收后接入pET28aDel線性化載體中，并轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化成功的單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并將鑒定正確的表達(dá)載體分別命名為p28aD-Cry1IaD5、p28aD-Cry1IaD10、p28aD-Cry1IaD13、p28aD-Cry1IaD16、p28aDCry1IaD24和p28aD-Cry1IaD32（表2）。

1.2.2 Cry1Ia蛋白的表達(dá)分析 將成功構(gòu)建的表達(dá)載體用熱激法分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 Star（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)10 h。分別將9個(gè)菌株的單克隆接種于含有50μg/mL卡那霉素LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)10 h；按1∶1000轉(zhuǎn)接至含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值為0.8；加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG），使終濃度為1.0mmol/L，16℃125 r/min誘導(dǎo)6 h。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析。采用Image Lab 6.0.1軟件對(duì)蛋白表達(dá)結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.3cry1Ia基因的mRNA局部結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 用RNA structure 6.1預(yù)測(cè)cry1Ia、cry1IaD5、cry1IaD10、cry1IaD13、cry1IaD16、cry1IaD24、cry1IaD32、cry1I-D44和cry1IaD73基因的起始密碼子附近（-4～+37 nt）核苷酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)[25]，選擇每個(gè)序列具有最低折疊能量的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。利用SPSS 23.0對(duì)9種蛋白表達(dá)量和9種基因的起始密碼子附近核苷酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體的構(gòu)建及鑒定

研究共使用了Cry1Ia蛋白的8種N端缺失表達(dá)載體，其中，p28aD-Cry1IaD5、p28aD-Cry1IaD10、p28aD-Cry1IaD13、p28aD-Cry1IaD16、p28aD-Cry1-IaD24和p28aD-Cry1IaD32等6種表達(dá)載體是本研究構(gòu)建（圖1-A）。通過對(duì)8種N端缺失表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示，目的片段的大小與預(yù)期一致，表明載體構(gòu)建成功（圖1-B）。

2.2 N端信號(hào)肽缺失對(duì)Cry1Ia蛋白表達(dá)量的影響

將酶切鑒定正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21 Star（DE3）感受態(tài)細(xì)胞原核表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Cry1Ia和8種突變體蛋白均能成功表達(dá)，目的蛋白大小與預(yù)期一致（圖2、表2）。用Image Lab軟件對(duì)圖2中的目的條帶進(jìn)行相對(duì)定量，將Cry1Ia作為對(duì)照（表達(dá)量記為1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表3），Cry1IaD32和Cry1IaD44的表達(dá)量最高，分別約為對(duì)照Cry1Ia的1.43倍和1.12倍；Cry1IaD13和Cry1IaD16的表達(dá)量與對(duì)照Cry1Ia持平，分別為對(duì)照Cry1Ia的1.04倍和1.07倍；而Cry1IaD5、Cry1IaD10、Cry1IaD24和Cry1IaD73的表達(dá)量均低于對(duì)照Cry1Ia。說明Cry1Ia的N端信號(hào)肽缺失不同程度影響其蛋白表達(dá)，但與對(duì)照間差異不顯著。

表3 蛋白表達(dá)相對(duì)定量

2.3 cry1Ia基因的mRNA分析

利用RNA structure 6.1預(yù)測(cè)了cry1Ia和8種5′端堿基缺失基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3所示，cry1IaD24與cry1Ia起始密碼子（-4～+37）附近的核苷酸區(qū)域預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，均僅包含一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且雙股螺旋內(nèi)部僅含有一個(gè)GC配對(duì)，該結(jié)構(gòu)導(dǎo)致二者熱穩(wěn)定性接近，ΔG分別為-0.7 kcal/mol和-0.6 kcal/mol；cry1IaD13基因的mRNA也包含一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，但雙股螺旋中存在2個(gè)GC配對(duì)，從而增加了該結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性（ΔG＝-4.0 kcal/mol）；其他幾個(gè)突變體基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)均包含多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中，cry1IaD5和cry1IaD73莖環(huán)結(jié)構(gòu)最多，且GC含量相對(duì)較高，熱穩(wěn)定性也最高。

進(jìn)一步對(duì)Cry1Ia蛋白表達(dá)量和對(duì)應(yīng)基因的起始密碼子附近核苷酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，2個(gè)變量間相關(guān)系數(shù)為0.377，在95%水平下不顯著，所以，2個(gè)變量間無顯著相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

前期研究表明，Cry1Ia蛋白的N端信號(hào)肽Iasp跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)eGFP蛋白的性能較弱，但是具有作為融合標(biāo)簽的潛力，可改善多種蛋白，比如eGFP、MMP13和GDF8在大腸桿菌BL21 Star（DE3）中的表達(dá)[22]。本試驗(yàn)為了研究Iasp不同區(qū)域?qū)ry1Ia蛋白表達(dá)的影響，分析了8種Iasp的缺失突變體，結(jié)果顯示，Cry1Ia蛋白和8種缺失突變體在大腸桿菌中均獲得了較好的表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物的大小與預(yù)期一致，該結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[22，26]。

本研究用Image Lab軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行相對(duì)定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cry1IaD32和Cry1IaD44的表達(dá)量高于Cry1Ia，Cry1IaD13和Cry1IaD16的表達(dá)量同Cry1Ia基本持平，其余4種蛋白的表達(dá)量低于Cry1Ia。但整體而言，Cry1Ia和8種突變體蛋白表達(dá)水平差異不大。該結(jié)果表明，Cry1Ia蛋白N端氨基酸序列不同程度缺失對(duì)Cry1Ia蛋白表達(dá)無顯著影響。有研究發(fā)現(xiàn)，在原核細(xì)胞中蛋白表達(dá)量受多種因素影響，其中，SD序列與起始密碼子AUG之間的序列及其長度會(huì)影響肽鏈的翻譯效率[27]，二者之間的堿基組成和排列順序通過影響雙股螺旋的結(jié)構(gòu)參數(shù)而改變起始密碼子AUG在核糖體中相對(duì)角度，進(jìn)而影響翻譯效率[28]。值得注意的是，起始密碼子附近的核酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定也是關(guān)鍵因素之一[22，29-30]。前人研究發(fā)現(xiàn)，熱穩(wěn)定性較低的基因蛋白表達(dá)水平較高，比如，KUDLA等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在不同GFP編碼序列的5′端添加一段二級(jí)結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性低的前導(dǎo)序列，獲得的融合基因高水平表達(dá)；GAO等[22]研究發(fā)現(xiàn)，iegfp起始密碼子附近核苷酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)穩(wěn)定性低于egfp，而IeGFP蛋白表達(dá)量卻高于eGFP。本研究結(jié)果表明，熱穩(wěn)定性從弱到 強(qiáng) 依 次 為Cry1Ia、Cry1IaD24、Cry1IaD32、Cry1IaD10、Cry1IaD44、Cry1IaD13、Cry1IaD16、Cry1IaD73、Cry1IaD5；蛋白表達(dá)量從高到低依次為Cry1IaD32、Cry1IaD44、Cry1IaD16、Cry1IaD13、Cry1Ia、Cry1IaD24、Cry1IaD73、Cry1IaD5、Cry1IaD10；關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，二者無顯著相關(guān)性。這與前人研究結(jié)果不一致[22，29]，可能是由于Cry1Ia信號(hào)肽對(duì)自身蛋白與其他融合蛋白的影響有所差異，也有可能是由于重復(fù)次數(shù)有限且缺少轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的精確定量。因此，本研究中表達(dá)量與mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

本研究構(gòu)建了一系列Cry1Ia蛋白N端信號(hào)肽缺失突變體，首次研究了不同程度信號(hào)肽缺失對(duì)其自身蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Iasp不同程度缺失影響其蛋白表達(dá)，但表達(dá)水平差異不大。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步探究Iasp的功能奠定了一定理論基礎(chǔ)。