張露丹， 周丹， 劉寶， 曹慧軍， 費(fèi)櫻,***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

自1928年世界上第1種抗生素—青霉素被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，抗菌藥物與病原微生物之間的抗?fàn)帍奈赐Ｖ筟1]。雖然針對(duì)耐藥菌的新藥研發(fā)取得了較大的進(jìn)展，但細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生藥物滅活酶、鈍化酶、藥物作用靶位結(jié)構(gòu)改變等耐藥機(jī)制產(chǎn)生了各種多重耐藥[2-3]。全國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)收集國(guó)內(nèi)13所二級(jí)和36所三級(jí)醫(yī)院臨床分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，由于不同地區(qū)不同醫(yī)院抗菌藥物使用不同，不同醫(yī)院分離的主要細(xì)菌也不盡相同，細(xì)菌耐藥性也存在很大差異[4-5]。貴州某三甲醫(yī)院是集醫(yī)療、教學(xué)、科研及健康管理為一體的大型綜合性醫(yī)院，其細(xì)菌耐藥形勢(shì)有其自身的特點(diǎn)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性的變遷，防止耐藥菌株的流行十分必要。因此，本研究選取該院2015—2019年細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，對(duì)檢出的細(xì)菌分布和藥敏結(jié)果進(jìn)行分析，為醫(yī)院管理部門(mén)制定相關(guān)控制措施和臨床醫(yī)生合理使用抗菌藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來(lái)源 收集2015年1月1日—2019年12月31日醫(yī)院不同標(biāo)本分離的所有需氧菌(真菌、分枝桿菌除外)32 277株，標(biāo)本來(lái)源包括呼吸道(n=14 462)、尿液(n=5 281)、傷口膿液(n=4 475)、血(n=3 540)、漿膜腔積液(n=1 438)、腦脊液(n=207)、生殖道(n=848)及其他(包括關(guān)節(jié)液、膽汁、胃液、活組織及乳汁等，n=2 026)。見(jiàn)表1。

1.1.2主要試劑與儀器 哥倫比亞血瓊脂、嗜血桿菌巧克力瓊脂、Muller Hinton瓊脂、含血Muller Hinton瓊脂、頭孢硝噻吩紙片(鄭州安圖生物工程股份有限公司)，藥敏紙片(英國(guó)OXOID公司)，多黏菌素B E-test檢測(cè)條(溫州市康泰生物科技有限公司)，MicroScan WalkAway SI 96 plus全自動(dòng)細(xì)菌鑒定與藥敏分析儀、Pos Combo Panel Type 33和Neg Urine Combo Panel Type 61藥敏卡(美國(guó)Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定與藥敏分析儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)，細(xì)菌鑒定采用8進(jìn)制計(jì)算法將28個(gè)生化反應(yīng)轉(zhuǎn)換成8位生物數(shù)碼，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)將這些生物數(shù)碼與編碼數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)獲得相似系統(tǒng)鑒定值及菌種鑒定，部分苛養(yǎng)菌采用手工生化管輔助鑒定[6]；藥敏試驗(yàn)采用最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)法、紙片擴(kuò)散 (kindy-bauer, KB)法和E-test法，藥敏結(jié)果判讀參照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI；2018版)M100-S28標(biāo)準(zhǔn)[7]，對(duì)替加環(huán)素的藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)≤2 mg/L為敏感，≥8 mg/L 耐藥[8]。

1.2.2質(zhì)控菌株 金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、流感嗜血桿菌ATCC49247、肺炎鏈球菌ATCC49619。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Whonet 5.6軟件對(duì)細(xì)菌檢出率和耐藥率數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，使用SPSS 26軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定性資料采用頻數(shù)(%)表示，檢出率或耐藥率的比較及年度線性變化趨勢(shì)采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床分離細(xì)菌

共分離32 277株細(xì)菌，其中革蘭陽(yáng)性菌9 080株(占28.1%)，革蘭陰性菌23 197 株(占71.9%)。革蘭陰性菌居前5位的分別是大腸埃希菌(6 047株，18.7%)、克雷伯菌屬(5 114 株，15.8%)、不動(dòng)桿菌屬(3 410株，10.6%)、銅綠假單胞菌(2 037株，6.3%)及腸桿菌屬(1 793株，5.6%)，革蘭陽(yáng)性菌居前5位的分別是凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase-negativestaphylococcus，CNS，3 558株，11.0%)、金黃色葡萄球菌(2 425株，7.5%)、腸球菌屬(2 405株，7.5%)、肺炎鏈球菌(251株，0.8%)及無(wú)乳鏈球菌(109株，0.3%)。見(jiàn)表1。

表1 2015—2019年貴州省某三甲醫(yī)院臨床標(biāo)本分離細(xì)菌[n(%)]

2.2 分離細(xì)菌的標(biāo)本來(lái)源

分離自臨床的32 277株細(xì)菌，主要來(lái)源于呼吸道和尿液標(biāo)本，分別占44.8%、16.4%，其次傷口膿液和血液標(biāo)本占比也較高，分別占13.9%、11%，漿膜腔積液標(biāo)本占4.4%，生殖道標(biāo)本占2.6%，腦脊液標(biāo)本占0.6%，其他標(biāo)本占6.3%。

2.3 不同標(biāo)本來(lái)源分離的細(xì)菌

呼吸道標(biāo)本主要分離細(xì)菌為肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌，泌尿道標(biāo)本主要分離細(xì)菌為大腸埃希菌、屎腸球菌和肺炎克雷伯菌，傷口膿液標(biāo)本主要分離細(xì)菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌，血標(biāo)本主要分離細(xì)菌為CNS、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌。見(jiàn)表2。

表2 2015—2019年貴州省某三甲醫(yī)院不同來(lái)源標(biāo)本居前5位的細(xì)菌種類

2.4 革蘭陽(yáng)性菌藥敏結(jié)果

2.4.1葡萄球菌屬 2015—2019年 5年間金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林CNS(methicillin-resistant CNS，MRCNS)對(duì)利福平耐藥率均呈下降趨勢(shì)(P<0.032)，甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-sensitiveS.aureus，MSSA)對(duì)克林霉素耐藥率也有下降趨勢(shì)(P<0.001)；未檢出對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥金黃色球菌，極少數(shù)MSSA對(duì)利奈唑胺耐藥；未檢出對(duì)萬(wàn)古霉素和利奈唑胺耐藥的MRCNS，極少數(shù)MRCNS對(duì)萬(wàn)古霉素和利奈唑胺耐藥，葡萄球菌屬對(duì)奎奴普丁或達(dá)福普汀耐藥率<2.7%；甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(meticillin-resistantS.aureus，MRSA)和MRCNS對(duì)青霉素G、慶大霉素、利福平、氟喹諾酮類抗生素、復(fù)方新諾明、克林霉素、紅霉素、奎奴普丁或達(dá)福普汀及四環(huán)素的耐藥率明顯>MSSA和MSCNS(P<0.002)。見(jiàn)表3和表4。

表3 2015—2019年貴州省某三甲醫(yī)院金黃色葡萄球菌對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的耐藥率

表4 2015—2019年貴州省某三甲醫(yī)院CNS對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的耐藥性

2.4.2腸球菌屬 2015—2019年糞腸球菌對(duì)所監(jiān)測(cè)抗菌藥物的耐藥率無(wú)明顯變化，糞腸球菌對(duì)利奈唑胺、萬(wàn)古霉素耐藥率分別<2.1%和0.7%；屎腸球菌對(duì)高濃度慶大霉素、高濃度鏈霉素、利福平、環(huán)丙沙星、呋喃妥因的耐藥率有下降趨勢(shì)(P<0.03)；未檢出對(duì)利奈唑胺耐藥的屎腸球菌，對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥率小于0.4%，屎腸球菌對(duì)奎奴普丁/達(dá)福普汀耐藥率為10.8%。屎腸球菌對(duì)青霉素、氨芐西林、高濃度慶大霉素、高濃度鏈霉素、利福平、氟喹諾酮類抗菌藥物、紅霉素、呋喃妥因的耐藥率>糞腸球菌(P<0.001)，糞腸球菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率高于屎腸球菌(P<0.001)。見(jiàn)表5。

表5 2015—2019年貴州省某三甲醫(yī)院糞腸球菌和屎腸球菌對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的耐藥率

2.4.3鏈球菌屬 β溶血性鏈球菌對(duì)青霉素耐藥率較低(<2%)，對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、利奈唑胺、萬(wàn)古霉素保持高度敏感耐藥率均為0%，對(duì)紅霉素、克林霉素的耐藥率較高(>60%)。肺炎鏈球菌主要分離自非腦脊液標(biāo)本，對(duì)紅霉素、克林霉素耐藥率>90%，對(duì)阿莫西林、左氧氟沙星相對(duì)敏感，耐藥率<6.4%，未檢測(cè)出耐利奈唑胺和萬(wàn)古霉素的鏈球菌屬細(xì)菌。

2.5 革蘭陰性菌藥敏結(jié)果

2.5.1腸桿菌科細(xì)菌 2015—2019年大腸埃希菌對(duì)青霉素類、頭孢菌素類(除頭孢他啶)、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑、四環(huán)素耐藥率均>60%，對(duì)氨曲南、氟喹諾酮類藥物耐藥率在50%左右，對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥率也在40%左右，均高于肺炎克雷伯菌(P<0.001)，但對(duì)頭孢菌素類、氨曲南、氨基糖苷類、四環(huán)素有下降趨勢(shì)(P<0.04)；對(duì)β-內(nèi)酰胺類-酶抑制劑合劑(除氨芐西林/舒巴坦)耐藥率<10%，低于肺炎克雷伯菌(P<0.001)，對(duì)碳青霉烯類、阿米卡星的耐藥率較低(<2.4%)，未檢出對(duì)替加環(huán)素耐藥的大腸埃希菌；2015—2019年肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢菌素類(除頭孢他啶)、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑耐藥率大于40%，對(duì)β-內(nèi)酰胺類-酶抑制劑合劑(除氨芐西林/舒巴坦)、氟喹諾酮類抗生素耐藥率為20%左右，5年間有增長(zhǎng)趨勢(shì)(P<0.005)；對(duì)碳青霉烯類、阿米卡星的耐藥率在10%左右，>大腸埃希菌(P<0.001)，且5年間有增長(zhǎng)趨勢(shì)(P<0.001)；對(duì)替加環(huán)素耐藥率為0.3%，5年間有下降趨勢(shì)。見(jiàn)表6。

表6 2015—2019年貴州省某三甲醫(yī)院大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的耐藥率

2.5.2非發(fā)酵革蘭陰性菌 2015—2019年銅綠假單胞菌對(duì)頭孢菌素類(除頭孢他啶)、哌拉西林/他唑巴坦、碳青霉烯類、氨曲南、慶大霉素、妥布霉素、氟喹諾酮類耐藥率在10%～25%之間，且對(duì)后4種抗生素5年間耐藥率有下降趨勢(shì)(P<0.03)，對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星耐藥率較低，分別為10%和5%左右，但五年間對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率有升高趨勢(shì)(P=0.048)。2015—2019年鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢菌素類、氨曲南、碳青霉烯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、四環(huán)素及甲氧芐啶-磺胺甲噁唑耐藥率菌均>65%，>銅綠假單胞菌(P<0.001)，且5年間有增長(zhǎng)趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.014)，未檢出對(duì)替加環(huán)素耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌。見(jiàn)表7。

表7 2015—2019年貴州省某三甲醫(yī)院銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的耐藥率

2.5.3其他革蘭陰性桿菌 流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥率>55%，對(duì)亞胺培南、美羅培南、哌拉西林-他唑巴坦高度敏感，但3種抗生素均已經(jīng)出現(xiàn)非敏感菌株，不敏感率2.7%～4.8%；環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟及氨曲南均出現(xiàn)較高的不敏感率，不敏感率15.6%～34%。

2.6 多重耐藥菌檢出情況

多重耐藥菌檢出結(jié)果顯示，2015—2019年MRSA、MRCNS、耐萬(wàn)古霉素腸球菌(vancomycin-resistantEnterococcus，VRE)、耐碳青霉烯大腸埃希菌(carbapenem-resistantE.coli，CRECO)和耐碳青霉烯銅綠假單胞菌(carbapenem-resistantPseudomonasaeruginosa，CRPA)的檢出率無(wú)明顯的增減趨勢(shì)，其5年平均檢出率分別為29.1%、84.1%、0.2%、1.0%及28.0%；而5年間耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantklebsiellapneumoniae，CRKP)和耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)的檢出率逐年明顯上升(P<0.001，表8)。重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)居監(jiān)測(cè)七種多重耐藥菌檢出科室的首位，神經(jīng)內(nèi)科和神經(jīng)外科為CRKP、CRPA及CRAB檢出科室的第2位或第3位。見(jiàn)表9。

表8 2015—2019年貴州省某三甲醫(yī)院多重耐藥菌檢出率

表9 貴州省2015—2019年某三甲醫(yī)院不同多重耐藥菌居前5位的科室

3 討論

本研究中5年間臨床分離細(xì)菌的菌株總數(shù)、革蘭陽(yáng)性或陰性菌比例和分離居前5位細(xì)菌與2019年中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(China antimicrobial surveillance network, CHINET)三級(jí)醫(yī)院細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)和中南大學(xué)附屬醫(yī)院細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)基本一致[4，9]。臨床分離菌株標(biāo)本來(lái)源第1位為呼吸道標(biāo)本(44.8%)高于中南大學(xué)附屬醫(yī)院(39.3%)和武漢同濟(jì)醫(yī)院(34.6%)，而血液標(biāo)本位于尿液、傷口膿液標(biāo)本之后居第4位[9-10]。雖然臨床微生物實(shí)驗(yàn)室通過(guò)向臨床科室宣教鼓勵(lì)送檢更有意義的血液等無(wú)菌體液標(biāo)本，但送檢率仍處于較低水平。血液標(biāo)本分離株中CNS占36.9%，略高于全國(guó)平均水平[11]。有報(bào)道指出CNS血培養(yǎng)陽(yáng)性僅12%～26%被診斷為血流感染[12]，CNS作為條件致病菌，由于免疫抑制劑、化療藥物的應(yīng)用以及侵襲性的診療操作，使其在醫(yī)院感染病原菌中所占比例越來(lái)越高。采血過(guò)程中未嚴(yán)格無(wú)菌操作也會(huì)引起污染，因此需多次送檢血培養(yǎng)，同時(shí)結(jié)合病史、其它實(shí)驗(yàn)室檢查(白細(xì)胞計(jì)數(shù)、C-反應(yīng)蛋白、降鈣素等)、血培養(yǎng)陽(yáng)性套數(shù)及血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)時(shí)間等因素綜合分析。

2015—2019年5年間金黃色葡萄球菌對(duì)利福平耐藥率逐年下降，利福平耐藥與rpoB基因突變密切相關(guān)，而且在rpoB基因突變的過(guò)程中利福平是主要的選擇性壓力[13]，故本研究中利福平耐藥率逐年下降可能與環(huán)境中的利福平暴露減少相關(guān)。VRE在不同國(guó)家地區(qū)的檢出率不同，與其他國(guó)家和地區(qū)相比，國(guó)內(nèi)VRE檢出率仍較低[14-15]。VRE通常都以萬(wàn)古霉素耐藥屎腸球菌(vancomycin-resistantEnterococcusfaecium，VREfm)為主，本研究中VREfm維持在較低水平且無(wú)明顯變化趨勢(shì)，與2008—2017年CHINET腸球菌屬耐藥性監(jiān)測(cè)報(bào)告VREfm檢出率1.2%大致相同[16]。腸球菌球菌中最常檢出的耐萬(wàn)古霉素基因是vanA和vanB[17]，國(guó)內(nèi)外分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)引起人類感染的VRE是 CC17 克隆群屎腸球菌，除對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥外，還對(duì)氨芐西林、高濃度氨基糖苷類和喹諾酮類抗菌藥物耐藥，而且這些菌株通常攜帶有esp毒力基因[18]。

本研究中大腸埃希菌對(duì)青霉素類、頭孢菌素類(除頭孢他啶)、氨曲南的耐藥率>50%，且均>其他腸桿菌科細(xì)菌，提示其產(chǎn)ESBLs或AmpC的比例高于其他腸桿菌科細(xì)菌[10]。歐洲的耐藥菌感染所致死亡率調(diào)查研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第3代頭孢菌素耐藥大腸埃希菌是引起感染死亡最多的病原菌[19]，故微生物實(shí)驗(yàn)室中對(duì)于產(chǎn)ESBLs或AmpC大腸埃希菌的及時(shí)檢出對(duì)于指導(dǎo)臨床針對(duì)性用藥，從而降低病死率十分重要。碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem-resistantenterobacteriaceae，CRE)的流行播散造成了醫(yī)療保障體系沉重的負(fù)擔(dān)。由于碳青霉烯類耐藥菌株往往對(duì)其他臨床常用抗菌藥物也耐藥，使臨床的抗感染治療面臨無(wú)藥可用的困境，進(jìn)而導(dǎo)致其所致感染的高病死率[20]。根據(jù)全國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)CRE中CRKP占到72.4%[4]，本院5年間CRKP檢出率明顯增加，增長(zhǎng)趨勢(shì)與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道[21]一致，主要來(lái)于ICU、神經(jīng)外科、神經(jīng)內(nèi)科，這些病區(qū)的病人大多為免疫力低下的老年人或處于無(wú)意識(shí)狀態(tài)，而且使用侵入性醫(yī)療設(shè)備[22]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，神經(jīng)外科11例CRKP感染患者中7例證實(shí)為醫(yī)院感染，患者環(huán)境物體表面和部分醫(yī)務(wù)人員手、咽拭子檢出CRKP[23]。因此，CRKP存在醫(yī)院染暴發(fā)可能，通過(guò)CRKP感染患者的病原體污染環(huán)境和醫(yī)務(wù)人員的手導(dǎo)致感染的傳播。文獻(xiàn)報(bào)道，住院患者抗菌藥物的使用，尤其是廣譜頭孢菌素的使用與肺炎克雷伯菌的耐藥存在相關(guān)性，ICU病房中CRKP的檢出碳青霉烯類抗生素的使用是獨(dú)立的危險(xiǎn)因素[24]。

鮑曼不動(dòng)桿菌是引起醫(yī)院感染的常見(jiàn)致病菌[6]，近年來(lái)鮑曼不動(dòng)桿菌呈上升趨勢(shì)已成為非發(fā)酵菌的感染中第一位的細(xì)菌[9-10]。本院鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)3、4代頭孢菌素類、亞胺培南耐藥率逐年上升，多重耐藥不動(dòng)桿菌常存在染色體編碼的β-內(nèi)酰胺酶，包括C類頭孢菌素酶、D類苯唑西林酶及質(zhì)粒介導(dǎo)的A類β-內(nèi)酰胺酶[25]。2015—2019年5年間鮑曼不動(dòng)桿菌氨基糖苷類抗生素的耐藥率也逐年上升，16SrRNA甲基化酶是介導(dǎo)高水平氨基糖苷類抗生素耐藥的機(jī)制，armA和rmtB是主要基因[26]，奚俊等[27]報(bào)道armA在鮑曼不動(dòng)桿菌廣泛存在。銅綠假單胞菌除了天然耐藥外，對(duì)其他類抗菌藥物的耐藥率均在30%左右及以下，需要對(duì)銅綠假單胞菌的耐藥性持續(xù)關(guān)注。

在應(yīng)對(duì)多重耐藥菌的威脅時(shí)，只有堅(jiān)持以預(yù)防感染為中心，抗菌藥物管理和醫(yī)院感染管理兩手抓兩手硬[28]。細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)工作必要堅(jiān)持不懈，并加提高數(shù)據(jù)分析的能力，以及時(shí)反映醫(yī)院和地區(qū)的耐藥菌流行情況和變化趨勢(shì)，為醫(yī)院管理者制定感染控制政策提供參考，為醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)性使用抗菌藥物提供依據(jù)。