楊佳， 馬千里， 李盈甫， 王瑩瑩， 李傳印， 洪超， 朱小永， 肖云， 譚芳**

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 & 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南 昆明 650118； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 胸外科， 云南 昆明 650118； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 干療科， 云南 昆明 650032； 4.昆明醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 云南 昆明 650500； 5.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科， 云南 昆明 650118)

近年來隨著癌癥發(fā)病率和死亡率不斷升高，現(xiàn)已成為一個(gè)重要的公共健康問題[1]。肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，在中國的發(fā)病率和死亡率也很高，且呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。研究表明，吸煙是肺癌發(fā)生的最重要風(fēng)險(xiǎn)因素[3-4]，但只有15%的吸煙者可能會(huì)罹患肺癌，這說明其他因素在肺癌的發(fā)生中也發(fā)揮著重要的作用[5]，尤其是個(gè)體遺傳因素[6]。微RNA(miRNAs)是一類單鏈非編碼小RNA分子，長(zhǎng)度為21～24個(gè)核苷酸。miRNAs在真核細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能，超過60%的人類基因組蛋白編碼基因的表達(dá)可能會(huì)受到miRNAs的調(diào)控[7]。人類基因組編碼的miRNA分子在不同組織中的特異性表達(dá)，在胚胎發(fā)育、維持組織和器官正常生理功能中發(fā)揮重要作用[8]，在肺癌等大多數(shù)的人類腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了miRNA基因的異常表達(dá)[9]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNPs)是人類基因組中常見的遺傳變異，而miRNA基因編碼區(qū)域的SNPs可能會(huì)對(duì)miRNA表達(dá)及生物學(xué)活性產(chǎn)生影響，與多種人類疾病的易感性相關(guān)[10]，在對(duì)肺癌的研究中，發(fā)現(xiàn)了大量與肺癌易感性相關(guān)的miRNA基因SNPs位點(diǎn)[11-12]。由于不同研究納入的人群和樣本量的不同，不同相關(guān)性研究結(jié)果存在不一致的情況，比如2009年Tian等[13]的研究顯示，miR-196a2基因的SNPs 位點(diǎn)rs11614913的基因型CC可能會(huì)增加肺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)；但在2019年Mohamed等[14]則發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)基因型CC可能是肺癌發(fā)生的保護(hù)性因素。因此，為研究miRNA基因中的SNPs與云南漢族人群NSCLC的相關(guān)性，本研究選取了miR-196a2和miR-499基因的SNPs位點(diǎn)rs11614913和rs3746444，調(diào)查這2個(gè)SNPs位點(diǎn)在云南漢族人群NSCLC患者及健康人群中的分布特征，并分析這2個(gè)SNPs位點(diǎn)與云南漢族人群NSCLC易感性的關(guān)系，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1對(duì)象及分組 選取2015年10月—2018年5月確診的415例NSCLC的患者作為病例組，根據(jù)世界衛(wèi)生組織肺癌組織類型劃分標(biāo)準(zhǔn)，病例組按病理類型分為鱗癌、腺癌、鱗腺癌及其他類型肺癌；另外，采用國際肺癌臨床分期系統(tǒng)進(jìn)行臨床分期，病例組臨床分期分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ期。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)為：所有病例均為初次確診未接受放化療等抗腫瘤治療、未患有其他惡性腫瘤、無其他慢性疾病。選取同期體檢的健康個(gè)體462例為對(duì)照組，對(duì)照組的納入標(biāo)準(zhǔn)為：影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)肺部占位性病變、無刺激性干咳、血痰、胸痛等癥狀、未患有其他惡性腫瘤、無其他慢性疾病。所有研究對(duì)象均為居住于云南、彼此無血緣關(guān)系的漢族個(gè)體，年齡23～88 歲。

1.1.2主要試劑和儀器 QIAamp全血基因組 DNA 提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，QIAGENE公司，德國)，基因分型試劑(TaqMan Genotyping Master Mix，ABI公司，美國)，TaqMan探針分型試劑盒(rs11614913探針試劑盒編號(hào)為C___731185852_10和rs3746444探針試劑盒編號(hào)為C__2142612_40，ABI公司，美國)，ND-2000微量紫外可見分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，QuantStudio 6實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 采集空腹靜脈血5 mL，用EDTA·K2或肝素抗凝，使用全血基因組DNA提取試劑盒提取 DNA。用超微量紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度。

1.2.2基因分型 本研究采用TaqMan探針基因分型法對(duì)miR-196a2基因SNPs位點(diǎn)rs11614913和miR-499基因SNPs位點(diǎn)rs3746444進(jìn)行基因分型。基因分型PCR反應(yīng)體積為5 μL，包含SNPs分型試劑2.5 μL、TaqMan探針(20×)0.25 μL、樣品DNA 1 μL、雙蒸水1.25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陰性對(duì)照(以雙蒸水代替DNA模板樣本)。使用基因分型軟件TaqMan Genotyper Software進(jìn)行結(jié)果分析。同時(shí)，每個(gè)位點(diǎn)選取3個(gè)不同基因型的樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)分析病例組和對(duì)照組年齡差異，用χ2檢驗(yàn)分析病例組和對(duì)照組性別差異；PLINK軟件計(jì)算病例組和對(duì)照組中每個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型、等位基因頻率，哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinbergequilibrium，HWE)評(píng)價(jià)2組隨機(jī)樣本的群體代表性；使用χ2檢驗(yàn)分析病例組和對(duì)照組間等位基因和基因型頻率的分布差異，使用在線軟件SNPStats對(duì)2個(gè)SNPs位點(diǎn)的5種遺傳模式進(jìn)行分析[包括共顯性模式(codominant)、顯性模式(dominant)、隱性模式(recessive)、超顯性模式(overdominant)和邏輯加性模式(log-additive)]，根據(jù)赤池信息量準(zhǔn)則(akaikeinformationcriterion，AIC) 和貝葉斯信息準(zhǔn)則(bayesianinformationcriterions，BIC) 的數(shù)值來確定每個(gè)位點(diǎn)的最優(yōu)遺傳模式，即AIC和BIC數(shù)值最小的遺傳模式為最優(yōu)的遺傳模式。以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的基本特征

本研究共納入NSCLC患者415例，平均年齡(55.84±10.70)歲，其中男290例、女125例，按病理類型分為鱗癌患者150例、腺癌患者241例、鱗腺癌及其他類型肺癌患者24例，按臨床分期Ⅰ+Ⅱ期患者134例、Ⅲ+Ⅳ期患者281例。對(duì)照組462例，平均年齡(5.56±6.75)歲，其中男315例、女147例。病例組和對(duì)照組的年齡和性別分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 rs11614913和rs3746444位點(diǎn)等位基因、基因型與NSCLC的相關(guān)性

結(jié)果顯示，rs11614913和rs3746444位點(diǎn)的基因型在病例組和對(duì)照組中的分布均符合HWE定律(P>0.05)，說明本研究的樣本是具有群體代表性的隨機(jī)樣本。對(duì)2個(gè)SNPs位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率在病例組和對(duì)照組中分布特征進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)， rs11614913和rs3746444位點(diǎn)的等位基因和基因型在病例組和對(duì)照組中分布頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 rs11614913和rs3746444位點(diǎn)的等位基因和基因型在病例組和對(duì)照組的分布

2.3 遺傳模式分析miR-196a2和miR-499基因2個(gè)SNPs位點(diǎn)與NSCLC的相關(guān)性

miR-196a2和miR-499基因2個(gè)SNPs位點(diǎn)與NSCLC的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，對(duì)病例組和對(duì)照組的rs11614913和rs3746444的最優(yōu)遺傳模式均為超顯性遺傳模式。在超顯性遺傳模式中，2個(gè)SNPs位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組中分布頻率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 病例組與對(duì)照組SNPs位點(diǎn)rs11614913和rs3746444的遺傳模式分析

2.4 rs11614913和rs3746444位點(diǎn)與NSCLC病理類型和臨床分期的相關(guān)性

結(jié)果顯示，miR-196a2基因SNPs位點(diǎn)rs11614913和miR-499基因SNPs位點(diǎn)rs3467444可能與NSCLC的病理類型具有相關(guān)性，其中rs11614913等位基因C攜帶者患NSCLC腺癌的風(fēng)險(xiǎn)更高(OR=1.388，95%CI為1.038～1.857，P=0.027)，而rs3467444等位基因G的攜帶者可能更容易患NSCLC鱗癌(OR=9.713，95%CI為4.054～23.269，P<0.001)。見表3。

表3 SNPs位點(diǎn)rs11614913和rs3746444與NSCLC病理類型和臨床分期的關(guān)系

3 討論

有學(xué)者認(rèn)為，腫瘤組織中miRNA的表達(dá)異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[15]，而miRNA基因中的SNPs位點(diǎn)可能是影響miRNA表達(dá)的因素之一[16]。因此，miRNA基因中的SNPs可能是通過影響miRNA基因的表達(dá)而在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-196a2在肺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常肺組織[17]。rs11614913是一個(gè)位于miR-196a2基因成熟序列的變異位點(diǎn)，該SNPs位點(diǎn)可能與成熟miR-196a2的表達(dá)水平相關(guān)。近年來，該SNPs位點(diǎn)與腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性被廣泛研究[18-19]，其中有些研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)基因型CC可能與肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[7, 20]，而有些研究提示該位點(diǎn)基因型CC可能是肺癌發(fā)生的保護(hù)性因素[14]，也有些研究并未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與肺癌的相關(guān)性[21]。本研究結(jié)果表明該位點(diǎn)與云南漢族人群NSCLC易感性無關(guān)，但分層分析結(jié)果顯示，該位點(diǎn)可能與NSCLC的病理類型相關(guān)。以上研究表明miR-196a2基因中的多態(tài)性位點(diǎn)rs11614913與肺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性的結(jié)果存在不一致，這可能是由于不同研究所選的人群遺傳背景以及不同研究納入的樣本量大小不一致造成的。因此，未來仍需要開展更多大樣本量的相關(guān)性研究以及功能研究，以確定該SNPs位點(diǎn)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

研究還發(fā)現(xiàn)，miR-499在多種人類腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用[22-22]，可作為腫瘤治療候選靶標(biāo)[23]。在肺癌中的研究也發(fā)現(xiàn)，miR-499在肺癌發(fā)生中發(fā)揮抑癌基因作用[24]，且可作為肺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)記分子[25]，miR-499基因中的SNPs位點(diǎn)rs3746444不同基因型與成熟miR-499的表達(dá)水平有關(guān)[26]，這可能是該SNPs位點(diǎn)與腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的原因之一[27]。在肺癌的相關(guān)性研究中，Li等[28]的研究顯示，rs3746444等位基因C可能是肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素。但Vinci和Fan等[17, 29]的研究并未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與肺癌的相關(guān)性。同樣，本研究結(jié)果也未發(fā)現(xiàn)rs3746444與云南漢族人群NSCLC風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性(P>0.05)，但在分層分析中，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)可能與NSCLC的病理類型具有相關(guān)性。

綜上所述，本研究雖未發(fā)現(xiàn)miR-196a2基因SNPs位點(diǎn)rs11614913和miR-499基因SNPs位點(diǎn)rs3467444與云南漢族人群NSCLC風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性，但可能與NSCLC病理類型相關(guān)。