李婭亨， 楊希， 楊佳， 肖云， 許金美， 張新文， 朱小永， 姚宇峰， 嚴志凌**

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 & 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南 昆明 650118； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 婦科， 云南 昆明 650118； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科， 云南 昆明 650118)

宮頸癌(cervical cancer, CC)在全球女性惡性腫瘤中排名第4，其發(fā)病率和死亡率近年來呈現(xiàn)年輕化的趨勢[1]。CC的發(fā)生和發(fā)展主要分為兩個階段：宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和CC[2]。研究發(fā)現(xiàn)CC的發(fā)生和發(fā)展是多種因素長期相互作用導(dǎo)致的結(jié)果[3]。持續(xù)的高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是CC發(fā)生的必要條件之一，但是并非所有感染HPV的患者均發(fā)展成CC。此外，宿主的遺傳因素在CC的發(fā)生和發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用[4]，近年來，微RNA(miRNA)及其多態(tài)性與CC的相關(guān)性研究已成為世界范圍內(nèi)的研究熱點。miRNA是一類長度約為21～23個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，可以通過堿基互補的方式與靶基因mRNA的3-UTR結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA的降解或翻譯過程的抑制[5]，從而對靶基因的表達進行調(diào)控。大量研究表明miR-155和miR-200b在多種人類腫瘤中發(fā)揮作用[6-9]，其中包括CC[10-12]。而位于miRNA 基因初級轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA)或前體miRNA(pre-miRNA)序列中的變異位點可能會通過影響miRNA的剪切、加工和成熟過程影響成熟 miRNA 的表達，位于miRNA基因成熟序列中的變異可能會影響 miRNA與靶基因的結(jié)合，從而影響其對靶基因表達的調(diào)控，這可能是miRNA的基因變異在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的機制之一[5]。研究表明，miR-155和miR-200b基因中的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNPs)位點與多種惡性腫瘤密切相關(guān)[13-14]。例如，一些研究報道了miR-155基因的SNPs位點rs767649(T>A)與腫瘤的相關(guān)性，但不同研究的結(jié)論存在分歧[15-17]，該位點與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性尚未明確；而對于miR-200b基因中的SNPs位點rs9660710(C>A)與腫瘤的相關(guān)性研究較少[18-19]。因此，本研究選取miR-155基因SNPs位點rs767649(T>A)和miR-200b基因SNP位點rs9660710(C>A)，探究上述SNPs位點在云南漢族人群中CIN患者、CC患者及健康人群中的分布情況，并分析它們與CC發(fā)生風險的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1對象及分組 遵循知情同意原則，隨機選取 2016年4月—2018年10月于被診斷為CIN患者258例作為CIN組、被診斷為CC患者438 例作為CC組；選取同期參加體檢的HPV 陰性的健康女性511例作為對照組。CC組和CIN組患者符合《臨床診療指南-婦產(chǎn)科學(xué)分冊》相關(guān)診斷，年齡30～75歲，CC患者的臨床分期采用國際婦產(chǎn)科協(xié)會(federation international of gynecology and obstetrics，F(xiàn)IGO)的臨床分期標準進行分期；排除采樣前接受過放化療等抗腫瘤輔助治療者，患其他惡性腫瘤者。所有納入本研究的個體均為云南地區(qū)的漢族人群。

1.1.2主要試劑和儀器 QIAamp全血基因組 DNA 提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，QIAGENE公司，德國)，基因分型試劑(TaqMan Genotyping Master Mix，ABI公司，美國)，TaqMan探針分型試劑盒(rs767649探針試劑盒編號為C__212229_10，rs9660710探針試劑盒編號為C__30237426_20，ABI公司，美國)，ND-2000微量紫外可見分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，QuantStudio 6實時熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1全血基因組DNA的提取 采用EDTA·K2或肝素抗凝管，采集研究對象的空腹靜脈血5 mL，使用QIAamp全血基因組DNA提取試劑盒提取外周血基因組DNA，使用超微量紫外可見分光光度計ND-2000檢測基因組DNA的濃度和純度，存放于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2基因分型 采用TaqMan探針基因分型法對2個SNPs位點rs767649和rs9660710進行基因分型，反應(yīng)體積為5 μL(384孔板)，PCR反應(yīng)設(shè)陰性對照(以無酶無菌雙蒸水代替模板DNA)。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性10 min，92 ℃變性15 s、60 ℃退火1 min，40個循環(huán)，40 ℃長延伸5 min?；蚍中驮紨?shù)據(jù)采用QuantStudioTMReal Time PCR軟件進行分析，分型完成后隨機選取每個位點不同基因型的樣本進行測序驗證。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析比較各組間的年齡差異，采用哈迪-溫伯格平衡(hardy-weinbergequilibrium，HWE)檢驗樣品的代表性，采用χ2檢驗對2個SNPs位點rs767649和rs9660710的等位基因和基因型在3組中的分布頻率進行比較。采用遺傳模式分析軟件SNPStats分析rs767649和rs9660710的基因型與CC的相關(guān)性[20]，本研究納入分析的遺傳模式包括共顯性遺傳模式(codominant)、顯性遺傳模式(dominant)、隱性遺傳模式(recessive)、超顯性遺傳模式(overdominant)及邏輯累加模式(Log-additive)，并計算赤池信息量準則(akaikeinformationcriterion，AIC) 和貝葉斯信息準則(bayesianinformationcriterions，BIC) 的數(shù)值，選取AIC和BIC數(shù)值最小的模式為最優(yōu)遺傳模式；統(tǒng)計學(xué)分析過程中的多重比較采用Bonferroni校正，當校正后P<0.025(0.05/n,n=2)時，認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基本特征

本研究共納入?yún)⒓芋w檢的正常健康女性511例，平均年齡(47.07±7.27)歲；CIN組258例，平均年齡(46.08±9.57)歲；CC組438例，平均年齡(46.43±11.58)歲，鱗癌、腺癌及其他類型分別為363、59及16例；各組研究對象年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.069，P=0.344)。

2.2 樣本代表性分析

本研究采用HWE平衡檢驗樣本的群體代表性，結(jié)果顯示rs767649(T>A)和rs9660710(C>A)的基因型在對照組、CIN 組及CC組中的分布特征均符合HWE平衡(P>0.05)，表明本研究所納入的樣本具有群體代表性。見表1。

表1 各組研究對象rs767649和rs9660710的Hardy-Weinberg檢驗

2.3 rs767649和rs9660710位點的等位基因和基因型在對照組、CIN組及CC組的分布

結(jié)果顯示，miR-200b基因SNPs位點rs9660710的等位基因和基因型在CC組和對照組的分布頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009、0.023)，該位點等位基因A可能是CC發(fā)生的風險因素(OR=1.275, 95%CI為1.062～1.530)；miR-155基因SNPs位點rs767649的等位基因和基因型在3組間的分布頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.025)，表明該位點與CC和CIN的發(fā)生風險無關(guān)。見表2和表3。

表2 rs9660710的等位基因和基因型在3組中的分布

表3 rs767649的等位基因和基因型在3組中的分布

2.4 遺傳模式的分析

結(jié)果顯示，miR-200b基因SNPs位點rs9660710在CC組與對照組的比較中最優(yōu)的遺傳模式為隱性遺傳模式(該模式具有最小的AIC和BIC數(shù)值)，在該模式下基因型CC-CA相對于基因型AA來說是CC發(fā)生的保護性因素(OR=0.65， 95%CI為0.47～0.90，P=0.01)，miR-155基因SNPs位點rs767649位點的基因型在各組研究對象間的分布頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.025)。見表4和表5。

表4 SNPs位點rs767649和rs9660710在CC組和對照組比較中的遺傳模式分析

表5 SNPs位點rs767649和rs9660710在CIN組和對照組比較中的遺傳模式分析

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，除了高危HPV感染外，宿主的遺傳因素在CC的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[21]。SNPs是人類基因組中廣泛存在的遺傳標記，位于miRNA基因中的SNPs具有不同的生物學(xué)功能，可能會導(dǎo)致miRNA的異常表達，并影響疾病的發(fā)生[22]。因此本研究選取2個位于miRNA基因中的SNPs位點(miR-155基因的rs767649和miR-200b基因的rs9660710)，研究其與CIN和CC發(fā)生風險的相關(guān)性。

人類miR-155是由非轉(zhuǎn)錄B細胞整合簇(B cell integration cluster，BIC)基因編碼，位于21q21.3號染色體，是一類典型的多功能miRNA，涉及到許多關(guān)鍵的細胞功能，包括免疫應(yīng)答，DNA損傷應(yīng)答，炎癥以及腫瘤發(fā)生等，與多種惡性腫瘤密切相關(guān)[23]，在多種癌癥中表現(xiàn)為促癌的作用[8-9,24-25]。多項研究表明miR-155的表達在CC組織中明顯上調(diào)，且與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤及HPV相關(guān)，敲低miR-155表達可在體外抑制細胞的增殖、遷移及侵襲[26-27]。近年研究發(fā)現(xiàn)miR-155基因SNPs位點與多種人類疾病有相關(guān)性[28-30]。其中SNPs位點rs767649(T>A)位于miR-155的啟動子區(qū)域內(nèi)，Xie等[15]研究發(fā)現(xiàn)在肺癌中該位點T等位基因可能會增加miR-155的轉(zhuǎn)錄活性，促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，從而促進肺癌的發(fā)展風險，降低患者對放化療的敏感性，導(dǎo)致較差的預(yù)后效果。這與Dezfuli等[16]在伊朗人群中發(fā)現(xiàn)該位點等位基因A可能是非小細胞肺癌的保護性因素是一致的。同樣地，Ji等[17]發(fā)現(xiàn)肝細胞癌中miR-155在癌組織和癌旁組織中高表達，該位點的等位基因T與miR-155在肝癌組織和癌旁非腫瘤組織中的高表達有關(guān)，且可能與肝細胞癌的患病風險增加和預(yù)后不良有關(guān)。但是Wang等[13]研究表明，該位點等位基因T可能與miR-155的轉(zhuǎn)錄活性降低有關(guān)，TT基因型是CC的保護性因素。本研究結(jié)果顯示rs767649(T>A)與CC的發(fā)生風險無相關(guān)性(P>0.025)。以上研究表明，miR-155基因中的SNPs位點rs767649在不同腫瘤以及相同腫瘤中的研究結(jié)果均存在不一致的情況，這可能是由于不同研究選擇的疾病類型不一樣，不同類型的腫瘤的發(fā)病機制可能不同，因此miR-155發(fā)揮的作用也可能不同；也有可能是由于不同研究選擇的研究人群不同，不同的研究人群可能具有不同的遺傳背景，在不同的遺傳背景下該SNPs位點發(fā)揮的作用可能會受到影響；同時，不同研究納入的樣本數(shù)量不同也會對相關(guān)性研究的結(jié)果產(chǎn)生影響。Wang等[13]研究與本研究結(jié)果不一致的情況表明該位點與中國人群CC發(fā)生風險的關(guān)系還未明確。因此，未來可考慮開展更大樣本量的相關(guān)研究，以闡明miR-155基因SNPs位點rs767649與CC發(fā)病風險的關(guān)系。

人類miR-200家族由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-429及miR-141組成，有研究已表明，miR-200b為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的有效調(diào)節(jié)劑，可通過調(diào)節(jié)E-cadherin和波形蛋白等表達參與多種癌癥的轉(zhuǎn)移過程[31]。Zeng等[18]研究表明，miR-200b可以直接靶向FoxG1，從而促進CC的發(fā)展；然而Cheng等[19]研究表明，miR-200b可以通過抑制RhoE的表達，抑制CC的EMT過程，從而可能成為CC轉(zhuǎn)移患者的治療靶標；Xie等[14]研究表明，位于miR-200b、miR-200a及miR-429啟動子CpG島的rs9660710(C> A)在由C轉(zhuǎn)變?yōu)锳后會導(dǎo)致該CpG位點丟失，這可能會阻止CpG位點的甲基化并增加相關(guān)miRNA的表達，從而與非小細胞肺癌發(fā)生風險相關(guān)。而目前尚未有對于該SNPs位點與CC的相關(guān)性研究。本研究結(jié)果顯示，miR-200b基因SNPs位點rs9660710(C>A)等位基因A可能是云南人群CC發(fā)生的風險因素(OR=1.275， 95%CI為1.062～1.530，P=0.009)。該位點CC-CA基因型相對于AA基因型來說是云南人群CC發(fā)生的保護性因素(OR=0.65, 95%CI為0.47～0. 90P= 0.01)，該結(jié)果與Xie等[14]在肺癌中的研究結(jié)果一致。因此，本研究推測rs9660710位點可能是通過影響miR-200b基因啟動子區(qū)域的甲基化來影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性，影響成熟miR-200b的表達，并進一步影響下游的靶基因的表達，促進CC細胞的增殖、遷移及侵襲等，影響細胞的EMT過程，從而與CC的發(fā)生風險具有相關(guān)性。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示位于miR-200b基因SNPs位點rs9660710(C> A)可能與云南地區(qū)漢族人群CC發(fā)生風險相關(guān)，該位點等位基因A可能是CC發(fā)生的風險因素。由于該位點位于miR-200家族啟動子CpG序列，因此，該位點可能會通過影響啟動子區(qū)域的甲基化來影響miR-200家族相關(guān)miRNA的表達，但該位點與CC發(fā)生風險相關(guān)的機制仍然需要開展相關(guān)的功能研究進行驗證。