何思琦， 楊曼， 楊瑩， 王飛英， 王曉苓， 盧廷蓮 ， 角銘， 李奕平**

(1.大理大學 臨床醫(yī)學院， 云南 大理 671000； 2.云南大學附屬醫(yī)院 & 云南省第二人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科， 云南 昆明 650021； 3.云南省急救中心 急救科， 云南 昆明 650000)

研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一種多基因遺傳的慢性代謝性疾病，具有很強的遺傳易感性[1-2]。非編碼RNA(non-coding RNAs, ncRNAs)是一類基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，主要包括微小RNA(microRNA, miRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)，可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后或表觀遺傳水平調(diào)控靶基因基因表達，并作為信號、誘餌、引導、支架和監(jiān)督在疾病的遺傳易感性中發(fā)揮重要作用[3-6]。既往研究表明miRNA和lncRNA參與調(diào)控糖脂代謝紊亂及T2DM相關(guān)信號通路，并與T2DM發(fā)生發(fā)展有關(guān)[7-12]。miRNA和lncRNA中的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNPs)可能通過影響成熟miRNA和lncRNA的表達或其對靶基因的識別，從而影響T2DM的遺傳易感性[13-15]。近年來，有研究證明miRNA和lncRNA基因多態(tài)性可能與T2DM有關(guān)[14-16]，miR-129及CDKN2B-AS1基因被證實與糖脂代謝相關(guān)[8, 11-12, 17-18]。miR-129基因中的rs791595位于內(nèi)含子區(qū)域，可能與T2DM遺傳易感性有關(guān)[16]。而CDKN2B-AS1基因中的rs10811661位于外顯子區(qū)域，其等位基因與歐洲人群T2DM發(fā)病風險有關(guān)[14，19]。基于此，本研究選取miR-129基因SNPs位點rs791595及CDKN2B-AS1基因SNPs位點rs10811661，調(diào)查其在云南漢族人群T2DM患者和健康人群中的分布特征，并分析其與T2DM易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1對象及分組 隨機選取2018年2月—2020年3月內(nèi)分泌科住院的746名T2DM患者(男471例，女275例)作為T2DM組。根據(jù)1999年世界衛(wèi)生組織(world health organization, WHO)及2020年美國糖尿病協(xié)會(american diabetes association, ADA)[1]診斷標準：(1)空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)≥7.0 mmol/L或餐后2 h血漿血糖≥11.1 mmol/L+糖尿病(diabetes mellitus, DM)癥狀；(2)若無DM癥狀，需2次血糖檢測異常。此外，測量胰島素分泌和C肽水平以排除1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM)受試者。對40歲以下的受試者，檢測胰島細胞自身抗體和谷氨酸脫羧酶自身抗體，排除自身抗體陽性的受試者。本研究未納入妊娠婦女，且病史排除了特定類型的DM，如糖皮質(zhì)激素誘導的DM。選取同期體檢的842例非糖尿病(non-diabetic, NDM)個體(男502例、女340例)作為NDM組。NDM組研究對象具有以下情況將被排除：(1)FPG≥6.1 mmol/L和(或)糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin, HbA1C)≥5.7%[1]；(2)具有DM家族史；(3)具有高血壓病和冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等慢性疾病。所有研究對象均為居住于云南地區(qū)、彼此無血緣關(guān)系的漢族個體。

1.1.2主要試劑和儀器 凱杰微量血DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，批號163024128，貨號51106，德國QIAGENE公司)，基因分型試劑(TaqMan Genotyping Master Mix，ABI公司，美國)，TaqMan探針分型試劑盒(rs791595探針試劑盒編號為C___7564161_10和rs10811661探針試劑盒編號為C__31288917_10，Thermo Fisher Scientific公司，美國)，多功能微孔板讀數(shù)儀(Thermo Scientific Varioskan LUX公司，美國)，QuantStudio 6實時熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1糖脂代謝指標檢測 禁食12 h后清晨采集研究對象靜脈血，分離血清。采用己糖激酶法測定血清FPG，氧化酶法測定血清總膽固醇(total cholesterol, TC)，甘油磷酸氧化酶法測定血清甘油三酯(triglycerides, TG)，直接法測定血清高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)，酶法測定血清HbA1C。所有的代謝指標檢測均使用HITACH自動分析儀7600-020測定。

1.2.2基因組DNA的提取 采用凱杰微量血DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA，并采用多功能微孔板讀數(shù)儀對DNA的質(zhì)量進行檢測。

1.2.3SNPs位點篩選及基因分型 采用Taq Man-MGB探針法對miR-129基因SNPs位點rs791595和CDKN2B-AS1基因SNPs位點rs10811661進行基因分型。根據(jù)分型樣本數(shù)配置適量反應(yīng)體系后加入384孔板，于Quantstudio6 PCR儀進行基因分型。反應(yīng)體系為5 μL(PCR混懸液4 μL及25 mg/L DNA模板1 μL)。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，92 ℃變性10 s、60 ℃退火延伸1 min，共40個循環(huán)，最后40 ℃長延伸5 min。每塊384孔反應(yīng)板中包含每個SNPs位點的3個基因型(野生純合子、突變純合子、雜合子)的標準樣品作為基因分型實驗的陽性對照孔，同時設(shè)置陰性對照孔(用雙蒸水代替DNA模板)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 基本臨床特征

研究對象的基本臨床特征詳見表1，T2DM組和NDM組的年齡和性別比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。T2DM組男性患者明顯多于女性患者，且男性患者有更年輕化的發(fā)病趨勢。T2DM組與NDM組個體的糖脂代謝指標(TC、TG、LDL-C、FPG、HbA1C及HDL-C)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，提示T2DM患者具有明顯的糖脂代謝紊亂。

表1 T2DM組與NDM組受試者的臨床特征及糖脂代謝指標

2.2 SNPs位點rs791595和rs10811661等位基因和基因型與T2DM的相關(guān)性

HWE分析顯示，2個SNPs位點的基因型在T2DM組(P=0.858、0.457)及NDM組(P=0.058、0.068)的分布均符合HWE(P>0.05)，說明本研究的2組受試者均符合群體代表性。SNPs位點rs791595和rs10811661的等位基因和基因型在T2DM組和NDM組中的分布結(jié)果顯示，CDKN2B-AS1基因SNPs位點 rs10811661等位基因頻率在T2DM組和NDM組中分布比較，差異有統(tǒng)計學意義，該位點等位基因C可能是T2DM的保護性因素(OR=0.851，95%CI為0.740～0.979，P=0.024)；而miR-129基因SNP位點 rs791595等位基因及基因型頻率在T2DM組和NDM組中分布頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.025)。見表2。

表2 SNPs位點rs791595和rs10811661的等位基因和基因型在T2DM組和NDM組間的分布

2.3 顯性及隱性遺傳模式下rs791595和rs10811661與T2DM的相關(guān)性

采用Logistic回歸法分析SNPs位點rs791595位點和rs10811661在顯性及隱性遺傳模式下與T2DM的相關(guān)性。結(jié)果顯示，顯性遺傳模式下，rs10811661 位點的C/T-C/C基因型相較于TT基因型是T2DM疾病進展中的保護因素(OR=0.780，95%CI為0.620～0.960，P=0.021)；未發(fā)現(xiàn)rs10811661位點隱性及rs791595位點顯性和隱性遺傳模式下其基因型與T2DM存在相關(guān)性(P>0.025)。見表3和表4。

表3 SNPs位點rs791595在T2DM組與NDM組間顯性和隱性遺傳模式分析

表4 SNPs位點rs10811661在T2DM組與NDM組間顯性和隱性遺傳模式分析

2.4 SNPs位點rs791595和rs10811661的基因型與糖代謝指標的相關(guān)性

采用單因素方差分析SNPs位點rs791595和rs10811661的基因型與代謝指標的相關(guān)性。結(jié)果顯示，在T2DM組和NDM組中，2個SNPs位點rs791595及rs10811661各基因型的各糖脂代謝指標(包括FPG、TC、HDL-C、TG、LDL-C和HbA1C)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.017)。見表5～表8。

表5 T2DM組SNPs位點rs791595各基因型的糖脂代謝指標比較

表6 NDM組SNPs位點rs791595各基因型的糖脂代謝指標比較

表7 T2DM組SNPs位點rs10811661各基因型的糖脂代謝指標比較

表8 NDM組SNPs位點rs10811661各基因型的糖脂代謝指標比較

3 討論

T2DM發(fā)病機制復雜，具有強烈的遺傳傾向。大量證據(jù)表明miR-129和CDKN2B-AS1在T2DM的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[7, 10]。因此，本研究對746例T2DM患者和842例NDM個體miR-129和CDKN2B-AS1基因中的SNPs位點rs791595及rs10811661進行基因分型，評估其與中國云南漢族人群T2DM的相關(guān)性。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-129循環(huán)表達水平在T2DM及代謝綜合征(metabolic syndrome, MS)患者中顯著上調(diào)[7- 8]；miR-129與循環(huán)甘油水平、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路、葡萄糖攝取及消耗、血脂和炎性因子水平有關(guān)[8, 11-12]。遺傳相關(guān)性的研究亦表明miR-129基因SNPs位點rs791595可能與T2DM遺傳易感性有關(guān)。2014年，Hara等[15]通過全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-Wide Association Studies, GWAS)證實rs791595A等位基因為日本人群T2DM的風險等位基因(P=2.55×10-13,OR=1.17)。但Nemr等[22]及Goto等[23]的研究報道rs791595等位基因及基因型分布頻率在阿拉伯人群及日本人群T2DM組與對照組中差異無統(tǒng)計學意義。本研究也未發(fā)現(xiàn)miR-129基因SNPs位點rs791595等位基因及基因型與T2DM發(fā)病風險有關(guān)(P>0.05)。此外，2017年，Peng等[24]的研究顯示未發(fā)現(xiàn)rs791595與中國人群T2DM伴糖尿病視網(wǎng)膜病變存在關(guān)聯(lián)。提示引起SNPs位點rs791595研究結(jié)果存在差異的原因可能在于不同人群的T2DM風險等位基因頻率存在差異，且同一人群納入的不同研究對象及不同樣本量也會影響最終的實驗結(jié)果。

CDKN2B-AS1是DM易感基因周期素依賴性激酶抑制因子2B(cyclin dependent kinase inhibitor 2B,CDKN2B)的反義RNA[14, 19]。CDKN2B-AS1可通過調(diào)節(jié)CDKN2B啟動子促進脂代謝[17-18]，在DM環(huán)境中高表達[10, 25-26]。此外，CDKN2B-AS1還能與DM易感基因RBMS1穩(wěn)定結(jié)合并正向調(diào)控其表達[19，27]。對于CDKN2B-AS1基因SNPs位點rs10811661，本研究結(jié)果顯示rs10811661位點等位基因C在NDM組分布頻率高于T2DM組(P=0.024)，說明rs10811661的等位基因C可能是防止T2DM發(fā)生的保護性因素。2007年，來自英國的一項GWAS研究顯示rs10811661T等位基因與歐洲人群T2DM發(fā)病風險有關(guān)[14]。隨后，大量研究證實rs10811661等位基因T與韓國人群、中國人群、印度人群T2DM遺傳易感性顯著相關(guān)[28-32]。2010年，Cunnington等[13]報道DM風險等位基因rs10811661T與英國高加索人及混血南非DM人群中CDKN2B-AS1基因的低表達相關(guān)，該結(jié)果可能由于DM治療過程中某些降糖生物分子應(yīng)激性升高并靶向抑制CDKN2B-AS1基因表達引起。因此本研究推測rs10811661T等位基因與T2DM易感性有關(guān)可能由于其能引起體內(nèi)CDKN2B-AS1基因表達水平變化并進一步影響β細胞功能導致，但這仍需要進一步的功能研究來證實。

此外，Xu等[29]發(fā)現(xiàn)rs10811661隱性遺傳模式與中國T2DM人群T2DM相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)rs10811661顯性遺傳模式與T2DM的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，在顯性遺傳模式下，rs10811661 C/T-C/C基因型相較于TT基因型可能是T2DM疾病進展中的保護因素，這也與rs10811661 C可能是防止中國云南漢族人群T2DM發(fā)生的保護性因素結(jié)論相一致。但本研究未發(fā)現(xiàn)CDKN2B-AS1基因SNPs位點rs10811661基因型與糖脂代謝指標有關(guān)。與此同時，本研究也未發(fā)現(xiàn)miR-129基因SNPs位點rs791595基因型與糖脂代謝指標有關(guān)。造成該結(jié)果的原因可能是本研究納入的人群樣本量相對不足，需要在更大的人群中進行驗證。

綜上所述，本研究選取了miR-129基因及CDKN2B-AS1 基因的2個SNPs位點rs791595及rs10811661，研究其與中國漢族人群T2DM發(fā)生風險的相關(guān)性，結(jié)果提示CDKN2B-AS1基因的SNPs位點rs10811661可能與中國漢族人群T2DM遺傳易感性有關(guān)，這可能是通過影響成熟CDKN2B-AS1的表達及其與T2DM相關(guān)靶基因的結(jié)合實現(xiàn)的。關(guān)于miR-129基因的SNPs位點rs791595與T2DM的關(guān)聯(lián)目前研究較少，有待通過更多的人群相關(guān)性研究及擴大樣本量來揭示miR-129基因多態(tài)性對T2DM發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生的影響。