何思琦， 楊曼， 楊瑩， 王飛英， 王曉苓， 盧廷蓮 ， 角銘， 李奕平**

(1.大理大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院， 云南 大理 671000； 2.云南大學(xué)附屬醫(yī)院 & 云南省第二人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科， 云南 昆明 650021； 3.云南省急救中心 急救科， 云南 昆明 650000)

研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一種多基因遺傳的慢性代謝性疾病，具有很強(qiáng)的遺傳易感性[1-2]。非編碼RNA(non-coding RNAs, ncRNAs)是一類基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，主要包括微小RNA(microRNA, miRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)，可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后或表觀遺傳水平調(diào)控靶基因基因表達(dá)，并作為信號(hào)、誘餌、引導(dǎo)、支架和監(jiān)督在疾病的遺傳易感性中發(fā)揮重要作用[3-6]。既往研究表明miRNA和lncRNA參與調(diào)控糖脂代謝紊亂及T2DM相關(guān)信號(hào)通路，并與T2DM發(fā)生發(fā)展有關(guān)[7-12]。miRNA和lncRNA中的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNPs)可能通過影響成熟miRNA和lncRNA的表達(dá)或其對(duì)靶基因的識(shí)別，從而影響T2DM的遺傳易感性[13-15]。近年來，有研究證明miRNA和lncRNA基因多態(tài)性可能與T2DM有關(guān)[14-16]，miR-129及CDKN2B-AS1基因被證實(shí)與糖脂代謝相關(guān)[8, 11-12, 17-18]。miR-129基因中的rs791595位于內(nèi)含子區(qū)域，可能與T2DM遺傳易感性有關(guān)[16]。而CDKN2B-AS1基因中的rs10811661位于外顯子區(qū)域，其等位基因與歐洲人群T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[14，19]?；诖?，本研究選取miR-129基因SNPs位點(diǎn)rs791595及CDKN2B-AS1基因SNPs位點(diǎn)rs10811661，調(diào)查其在云南漢族人群T2DM患者和健康人群中的分布特征，并分析其與T2DM易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1對(duì)象及分組 隨機(jī)選取2018年2月—2020年3月內(nèi)分泌科住院的746名T2DM患者(男471例，女275例)作為T2DM組。根據(jù)1999年世界衛(wèi)生組織(world health organization, WHO)及2020年美國糖尿病協(xié)會(huì)(american diabetes association, ADA)[1]診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)≥7.0 mmol/L或餐后2 h血漿血糖≥11.1 mmol/L+糖尿病(diabetes mellitus, DM)癥狀；(2)若無DM癥狀，需2次血糖檢測異常。此外，測量胰島素分泌和C肽水平以排除1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM)受試者。對(duì)40歲以下的受試者，檢測胰島細(xì)胞自身抗體和谷氨酸脫羧酶自身抗體，排除自身抗體陽性的受試者。本研究未納入妊娠婦女，且病史排除了特定類型的DM，如糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的DM。選取同期體檢的842例非糖尿病(non-diabetic, NDM)個(gè)體(男502例、女340例)作為NDM組。NDM組研究對(duì)象具有以下情況將被排除：(1)FPG≥6.1 mmol/L和(或)糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin, HbA1C)≥5.7%[1]；(2)具有DM家族史；(3)具有高血壓病和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等慢性疾病。所有研究對(duì)象均為居住于云南地區(qū)、彼此無血緣關(guān)系的漢族個(gè)體。

1.1.2主要試劑和儀器 凱杰微量血DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，批號(hào)163024128，貨號(hào)51106，德國QIAGENE公司)，基因分型試劑(TaqMan Genotyping Master Mix，ABI公司，美國)，TaqMan探針分型試劑盒(rs791595探針試劑盒編號(hào)為C___7564161_10和rs10811661探針試劑盒編號(hào)為C__31288917_10，Thermo Fisher Scientific公司，美國)，多功能微孔板讀數(shù)儀(Thermo Scientific Varioskan LUX公司，美國)，QuantStudio 6實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1糖脂代謝指標(biāo)檢測 禁食12 h后清晨采集研究對(duì)象靜脈血，分離血清。采用己糖激酶法測定血清FPG，氧化酶法測定血清總膽固醇(total cholesterol, TC)，甘油磷酸氧化酶法測定血清甘油三酯(triglycerides, TG)，直接法測定血清高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)，酶法測定血清HbA1C。所有的代謝指標(biāo)檢測均使用HITACH自動(dòng)分析儀7600-020測定。

1.2.2基因組DNA的提取 采用凱杰微量血DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA，并采用多功能微孔板讀數(shù)儀對(duì)DNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測。

1.2.3SNPs位點(diǎn)篩選及基因分型 采用Taq Man-MGB探針法對(duì)miR-129基因SNPs位點(diǎn)rs791595和CDKN2B-AS1基因SNPs位點(diǎn)rs10811661進(jìn)行基因分型。根據(jù)分型樣本數(shù)配置適量反應(yīng)體系后加入384孔板，于Quantstudio6 PCR儀進(jìn)行基因分型。反應(yīng)體系為5 μL(PCR混懸液4 μL及25 mg/L DNA模板1 μL)。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，92 ℃變性10 s、60 ℃退火延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，最后40 ℃長延伸5 min。每塊384孔反應(yīng)板中包含每個(gè)SNPs位點(diǎn)的3個(gè)基因型(野生純合子、突變純合子、雜合子)的標(biāo)準(zhǔn)樣品作為基因分型實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照孔，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照孔(用雙蒸水代替DNA模板)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基本臨床特征

研究對(duì)象的基本臨床特征詳見表1，T2DM組和NDM組的年齡和性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。T2DM組男性患者明顯多于女性患者，且男性患者有更年輕化的發(fā)病趨勢。T2DM組與NDM組個(gè)體的糖脂代謝指標(biāo)(TC、TG、LDL-C、FPG、HbA1C及HDL-C)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，提示T2DM患者具有明顯的糖脂代謝紊亂。

表1 T2DM組與NDM組受試者的臨床特征及糖脂代謝指標(biāo)

2.2 SNPs位點(diǎn)rs791595和rs10811661等位基因和基因型與T2DM的相關(guān)性

HWE分析顯示，2個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型在T2DM組(P=0.858、0.457)及NDM組(P=0.058、0.068)的分布均符合HWE(P>0.05)，說明本研究的2組受試者均符合群體代表性。SNPs位點(diǎn)rs791595和rs10811661的等位基因和基因型在T2DM組和NDM組中的分布結(jié)果顯示，CDKN2B-AS1基因SNPs位點(diǎn) rs10811661等位基因頻率在T2DM組和NDM組中分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該位點(diǎn)等位基因C可能是T2DM的保護(hù)性因素(OR=0.851，95%CI為0.740～0.979，P=0.024)；而miR-129基因SNP位點(diǎn) rs791595等位基因及基因型頻率在T2DM組和NDM組中分布頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.025)。見表2。

表2 SNPs位點(diǎn)rs791595和rs10811661的等位基因和基因型在T2DM組和NDM組間的分布

2.3 顯性及隱性遺傳模式下rs791595和rs10811661與T2DM的相關(guān)性

采用Logistic回歸法分析SNPs位點(diǎn)rs791595位點(diǎn)和rs10811661在顯性及隱性遺傳模式下與T2DM的相關(guān)性。結(jié)果顯示，顯性遺傳模式下，rs10811661 位點(diǎn)的C/T-C/C基因型相較于TT基因型是T2DM疾病進(jìn)展中的保護(hù)因素(OR=0.780，95%CI為0.620～0.960，P=0.021)；未發(fā)現(xiàn)rs10811661位點(diǎn)隱性及rs791595位點(diǎn)顯性和隱性遺傳模式下其基因型與T2DM存在相關(guān)性(P>0.025)。見表3和表4。

表3 SNPs位點(diǎn)rs791595在T2DM組與NDM組間顯性和隱性遺傳模式分析

表4 SNPs位點(diǎn)rs10811661在T2DM組與NDM組間顯性和隱性遺傳模式分析

2.4 SNPs位點(diǎn)rs791595和rs10811661的基因型與糖代謝指標(biāo)的相關(guān)性

采用單因素方差分析SNPs位點(diǎn)rs791595和rs10811661的基因型與代謝指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，在T2DM組和NDM組中，2個(gè)SNPs位點(diǎn)rs791595及rs10811661各基因型的各糖脂代謝指標(biāo)(包括FPG、TC、HDL-C、TG、LDL-C和HbA1C)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.017)。見表5～表8。

表5 T2DM組SNPs位點(diǎn)rs791595各基因型的糖脂代謝指標(biāo)比較

表6 NDM組SNPs位點(diǎn)rs791595各基因型的糖脂代謝指標(biāo)比較

表7 T2DM組SNPs位點(diǎn)rs10811661各基因型的糖脂代謝指標(biāo)比較

表8 NDM組SNPs位點(diǎn)rs10811661各基因型的糖脂代謝指標(biāo)比較

3 討論

T2DM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，具有強(qiáng)烈的遺傳傾向。大量證據(jù)表明miR-129和CDKN2B-AS1在T2DM的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[7, 10]。因此，本研究對(duì)746例T2DM患者和842例NDM個(gè)體miR-129和CDKN2B-AS1基因中的SNPs位點(diǎn)rs791595及rs10811661進(jìn)行基因分型，評(píng)估其與中國云南漢族人群T2DM的相關(guān)性。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-129循環(huán)表達(dá)水平在T2DM及代謝綜合征(metabolic syndrome, MS)患者中顯著上調(diào)[7- 8]；miR-129與循環(huán)甘油水平、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號(hào)通路、葡萄糖攝取及消耗、血脂和炎性因子水平有關(guān)[8, 11-12]。遺傳相關(guān)性的研究亦表明miR-129基因SNPs位點(diǎn)rs791595可能與T2DM遺傳易感性有關(guān)。2014年，Hara等[15]通過全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-Wide Association Studies, GWAS)證實(shí)rs791595A等位基因?yàn)槿毡救巳篢2DM的風(fēng)險(xiǎn)等位基因(P=2.55×10-13,OR=1.17)。但Nemr等[22]及Goto等[23]的研究報(bào)道rs791595等位基因及基因型分布頻率在阿拉伯人群及日本人群T2DM組與對(duì)照組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究也未發(fā)現(xiàn)miR-129基因SNPs位點(diǎn)rs791595等位基因及基因型與T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)(P>0.05)。此外，2017年，Peng等[24]的研究顯示未發(fā)現(xiàn)rs791595與中國人群T2DM伴糖尿病視網(wǎng)膜病變存在關(guān)聯(lián)。提示引起SNPs位點(diǎn)rs791595研究結(jié)果存在差異的原因可能在于不同人群的T2DM風(fēng)險(xiǎn)等位基因頻率存在差異，且同一人群納入的不同研究對(duì)象及不同樣本量也會(huì)影響最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

CDKN2B-AS1是DM易感基因周期素依賴性激酶抑制因子2B(cyclin dependent kinase inhibitor 2B,CDKN2B)的反義RNA[14, 19]。CDKN2B-AS1可通過調(diào)節(jié)CDKN2B啟動(dòng)子促進(jìn)脂代謝[17-18]，在DM環(huán)境中高表達(dá)[10, 25-26]。此外，CDKN2B-AS1還能與DM易感基因RBMS1穩(wěn)定結(jié)合并正向調(diào)控其表達(dá)[19，27]。對(duì)于CDKN2B-AS1基因SNPs位點(diǎn)rs10811661，本研究結(jié)果顯示rs10811661位點(diǎn)等位基因C在NDM組分布頻率高于T2DM組(P=0.024)，說明rs10811661的等位基因C可能是防止T2DM發(fā)生的保護(hù)性因素。2007年，來自英國的一項(xiàng)GWAS研究顯示rs10811661T等位基因與歐洲人群T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[14]。隨后，大量研究證實(shí)rs10811661等位基因T與韓國人群、中國人群、印度人群T2DM遺傳易感性顯著相關(guān)[28-32]。2010年，Cunnington等[13]報(bào)道DM風(fēng)險(xiǎn)等位基因rs10811661T與英國高加索人及混血南非DM人群中CDKN2B-AS1基因的低表達(dá)相關(guān)，該結(jié)果可能由于DM治療過程中某些降糖生物分子應(yīng)激性升高并靶向抑制CDKN2B-AS1基因表達(dá)引起。因此本研究推測rs10811661T等位基因與T2DM易感性有關(guān)可能由于其能引起體內(nèi)CDKN2B-AS1基因表達(dá)水平變化并進(jìn)一步影響β細(xì)胞功能導(dǎo)致，但這仍需要進(jìn)一步的功能研究來證實(shí)。

此外，Xu等[29]發(fā)現(xiàn)rs10811661隱性遺傳模式與中國T2DM人群T2DM相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)rs10811661顯性遺傳模式與T2DM的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，在顯性遺傳模式下，rs10811661 C/T-C/C基因型相較于TT基因型可能是T2DM疾病進(jìn)展中的保護(hù)因素，這也與rs10811661 C可能是防止中國云南漢族人群T2DM發(fā)生的保護(hù)性因素結(jié)論相一致。但本研究未發(fā)現(xiàn)CDKN2B-AS1基因SNPs位點(diǎn)rs10811661基因型與糖脂代謝指標(biāo)有關(guān)。與此同時(shí)，本研究也未發(fā)現(xiàn)miR-129基因SNPs位點(diǎn)rs791595基因型與糖脂代謝指標(biāo)有關(guān)。造成該結(jié)果的原因可能是本研究納入的人群樣本量相對(duì)不足，需要在更大的人群中進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究選取了miR-129基因及CDKN2B-AS1 基因的2個(gè)SNPs位點(diǎn)rs791595及rs10811661，研究其與中國漢族人群T2DM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，結(jié)果提示CDKN2B-AS1基因的SNPs位點(diǎn)rs10811661可能與中國漢族人群T2DM遺傳易感性有關(guān)，這可能是通過影響成熟CDKN2B-AS1的表達(dá)及其與T2DM相關(guān)靶基因的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。關(guān)于miR-129基因的SNPs位點(diǎn)rs791595與T2DM的關(guān)聯(lián)目前研究較少，有待通過更多的人群相關(guān)性研究及擴(kuò)大樣本量來揭示miR-129基因多態(tài)性對(duì)T2DM發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生的影響。