吉訓志 胡麗松 秦曉威 楊藝秋 范睿 郝朝運

摘? 要：為研究胡椒不同時期體細胞胚中內(nèi)源激素變化，以‘熱引1號胡椒外種皮經(jīng)培養(yǎng)獲得的非胚性愈傷組織（Y）、胚性愈傷組織（P）、胚性愈傷組織與體細胞胚混合物（H）、體細胞胚（T）與體細胞胚增殖（Z）5個時期樣品為試驗材料，采用LC-MS/MS技術檢測不同時期胚性培養(yǎng)物的內(nèi)源激素種類與含量，以期找出內(nèi)源激素影響胡椒體細胞胚發(fā)生的關鍵因素。結(jié)果表明：在胡椒體細胞胚發(fā)生過程中，吲哚-3-乙酸（IAA）含量在H時期最高，在P時期最低，在H、T與Z時期逐漸降低。吲哚-3-丁酸（IBA）含量在Y時期最高，在P時期最低，在H、T與Z時期基本不變。吲哚-3-甲酸（ICA）含量在H時期最高，且只存在含有愈傷組織的Y、P與H時期。異戊烯腺嘌呤（IP）含量在H時期最高，在P時期最低，在T與Z時期接近于零。順式玉米素（cZ）含量在Y時期最高，其他時期都接近于零。茉莉酸甲酯（ME-JA）含量只存在Y時期和P時期，但Y時期含量高于P時期。茉莉酸（JA）含量在Z時期最高，在P時期最低，在H、T與Z時期逐漸升高。水楊酸（SA）含量在H時期最高，在Y時期最低，且H、T與Z時期先降后升。脫落酸（ABA）含量在H時期最高，在P時期最低，在T與Z時期基本不變。赤霉素類（GAS）主要存在于Y與P時期，H、T與Z時期含量很低。由此可見，IAA、SA與ABA可能與體細胞胚發(fā)生的相關性強，而cZ、MEJA與GAS可能與愈傷組織產(chǎn)生相關性強。

關鍵詞：胡椒;愈傷組織;體細胞胚;內(nèi)源激素

中圖分類號：S667.1? ? ?文獻標識碼：A

Changes of Endogenous Hormone During Different Stages of Somatic Embryogenesis of Piper nigrum

JI Xunzhi1，2，3，4， HU Lisong1，2，3，4， QIN Xiaowei1，2，3，4， YANG Yiqiu1，5， FAN Rui1，2，3，4， HAO Chaoyun1，2，3，4*

1. Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning， Hainan 571533， China; 2. Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Wanning， Hainan 571533， China; 3. Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China; 4. Hainan Sim Soonliang academician workstation， Wanning， Hainan 571533， China; 5. College of Tropical Crop， Yunnan Agricultural University， Puer， Yunnan 665000， China

Abstract： In order to investigate the changes of endogenous hormones during different stages of somatic embryogenesis of P. nigrum， the endogenous hormones in five different development processes were detected at non-embryonic callus stage （Y）， embryonic callus stage （P）， mixed stage of embryonic callus and somatic embryo （H）， somatic embryo stage （T） and stage of somatic embryo proliferation （Z） by the LC-MS/MS technique. The content of indole-3-acetic acid （IAA） decreased gradually in the period of H， T and Z during the process of pepper somatic embryogenesis. The content of indole-3-butyric acid （IBA） was the highest in the period of Y and the lowest in the period of P， and the content of IBA was basically unchanged in the period of H， T and Z. Indole-3- Formic acid （ICA） content was the highest in the period of H， and ICA only existed at callus stage. Isopentenyladenine （IP） content was the highest at H， and was the lowest at P and close to zero at T and Z. Zeatin （cZ） content was the highest at Y， and cZ content was close to zero at other stages. Methyl jasmonate （ME-JA） only existed at Y and P， and former content was higher than latter content. Jasmonic acid （JA） content was the highest at Z， JA content was the lowest at P and increased gradually at other stages. Salicylic acid （SA） content was the highest at H， and was the lowest at Y and increased after decreased at other stages. Abscisic acid （ABA） content was the highest at H， and was the lowest at P and unchanged basically at T and Z. Gibberellins （GAS） mainly existed at Y and P， the levels were low at H， T， and Z. Therefore， IAA， SA and ABA may be strongly correlated with somatic embryogenesis， while cZ， ME-JA and GAS may be strongly correlatws with callus production.

Keywords： Piper nigrum L.; callus; somatic embryogenesis; endogenous hormones

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.013

胡椒（Piper nigrum L.）為多年生熱帶攀援藤本植物，果實具有辛辣香氣，是世界最重要的香辛料作物，也是人們喜愛的調(diào)味品[1-2]。目前，我國以‘熱引1號胡椒為主栽品種，種苗來源一直以主蔓插條培育為主[3-4]。此法具有能夠穩(wěn)定保持種苗優(yōu)良性狀、后代發(fā)病率低等優(yōu)點，但對其母株選擇、苗圃規(guī)劃、種苗培育環(huán)境與日常管理有較高要求，并且易受天氣和人為因素的影響，成本高、周期長，無法滿足產(chǎn)業(yè)發(fā)展對于大量優(yōu)質(zhì)種苗的需求。植物組織培養(yǎng)技術是一種無性繁殖方式，通過體細胞胚發(fā)生進行植株再生，能夠極大地保留品種的優(yōu)良性狀和提高種苗的繁育效率，因此，組織培養(yǎng)技術對于胡椒種苗繁育具有重要的實用價值。

植物激素在調(diào)控細胞分化和生長方面具有重要作用，并在體細胞胚發(fā)生與發(fā)育方面起著調(diào)節(jié)作用[5]。目前，針對植物體細胞胚發(fā)生過程中內(nèi)源激素研究主要集中于龍眼[6]、荔枝[7]與橡膠[8]等熱帶經(jīng)濟作物。然而，不同植物品種的不同部位體細胞胚發(fā)生所需最佳培養(yǎng)條件各有不同，內(nèi)源激素種類與濃度是影響體細胞胚發(fā)生的重要因素。本研究擬以‘熱引1號胡椒為研究對象，在胡椒體細胞胚發(fā)生過程中的非胚性愈傷組織、胚性愈傷組織、愈傷組織與體細胞胚混合物、體細胞胚與體細胞胚增殖5個時期，研究不同時期胚性培養(yǎng)物的內(nèi)源激素種類和含量及與體細胞胚發(fā)生的關系，以期為進一步完善胡椒體細胞胚發(fā)生提供理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

挑取‘熱引1號胡椒外種皮，在MS培養(yǎng)基上25 ℃下暗培養(yǎng)60 d，獲得非胚性愈傷組織及培養(yǎng)相同時間獲得的胚性愈傷組織（圖1）。A為胡椒外種皮，試驗材料胡椒5個時期樣品分別標記如下：B為非胚性愈傷組織（Y）;C為胚性愈傷組織（P）;D為胚性愈傷組織與體細胞胚混合物（H）;E為體細胞胚（T）;F為體細胞胚增殖（Z）。對P光培養(yǎng)40 d，對H進行取樣;繼續(xù)對P光培養(yǎng)90 d，再次挑取完全的T;繼續(xù)對T光培養(yǎng)30 d，再次進行取樣。每次取樣后，立即對樣品用液氮速凍后進行?80 ℃的低溫保存。實驗重復3次。

1.2? 方法

1.2.1? 激素標準曲線的制作? 參照Malgorzata等[9]的方法，稱取激素標準品，用甲醇（色譜純）充分溶解后，取該溶液稀釋后配制成母液，再進行等度稀釋，以峰面積為縱坐標，標準品濃度為橫坐標制作標準曲線。

1.2.2? 粗提液的制備? 參照?imura等[10]的方法，稱取材料50 mg，重復3次，加入1 mL的激素提取劑進行研磨，取上清液，重復提取3次，進行冷凍高壓凍干后，加入1 mL甲醇（色譜純）重新溶解，用0.45 μm微孔濾膜過濾后，低溫保存，備用。

1.2.3? LC-MS/MS檢測條件? （1）色譜條件。參照Floková等[11]的方法，色譜柱為Waters色譜柱（Acquity Uplc Hss T3 C18 1.8 ?m，2.1 mm×100 mm）。流動相：超純水與乙腈（色譜純）的體積比按時間進行梯度洗脫，流速0.35 mL/min，時間0～8 min、8～9 min、9～12 min的水∶乙腈流動相體積比分別為95∶5、5∶95、95∶5。

（2）質(zhì)譜條件。參照Cui等[12]與Xiao等[13]的方法，利用標準品確定激素標準品的母離子與子離子最佳響應條件，并記錄最佳錐孔電壓和碰撞電壓。每個離子對根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（declustering potential， DP）和碰撞能（collision energy， CE）進行掃描檢測（表1，圖2）。樣本中激素的含量采用以下公式計算：

樣本中激素含量（ng/g）=BCD/1000。

式中，B為樣本中激素積分峰面積比值代入標準曲線得到的濃度值（ng/mL）;C為復溶時所用溶液的體積（μL）;D為稱取的樣本質(zhì)量（g）。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

用Analyst 1.6.1軟件處理液相LC-MS/MS聯(lián)用分析得到的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)，將檢測到的所有樣本激素的積分峰面積比值代入標準曲線線性方程進行計算，并代入計算公式，最終得到實際樣本中

激素的絕對含量數(shù)據(jù)，并采用IBM SPSS Statistics 25.0與GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVA及相關性分析，生成圖表并分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同時期胡椒體細胞胚生長素類（Auxin）含量變化

如圖3所示，在對不同發(fā)育時期吲哚-3-乙酸（IAA）進行測定發(fā)現(xiàn)，IAA含量在H時期最高達6.21 ng/g，在P時期IAA含量最低為0 ng/g。不過，在體細胞胚發(fā)生過程中的H、T與Z時期的IAA含量都顯著高于不分化的Y時期，但在體細胞胚發(fā)生過程中，IAA含量逐漸降低。

在對不同發(fā)育時期吲哚-3-丁酸（IBA）進行測定發(fā)現(xiàn)，IBA含量在Y時期最高達1.15 ng/g，在P時期IBA含量最低為0.08 ng/g。在體細胞胚發(fā)生過程中的H、T與Z時期的IBA含量基本不變，但三者的IBA含量都顯著低于Y時期。

在對不同發(fā)育時期吲哚-3-甲酸（ICA）進行測定發(fā)現(xiàn)，ICA含量在H時期最高達1.58 ng/g，在T和Z時期ICA含量最低為0 ng/g。另外ICA只存在含有愈傷組織的Y、P與H時期。

在同一時期的生長素類激素比較中，Y時期中的IBA含量最高;在P時期中的ICA含量最高;在體細胞胚發(fā)生的H、T與Z時期中的IAA含量最高。由相關結(jié)果分析可知，IAA可能與胡椒愈傷組織開始分化體細胞胚有關，而高含量的IBA可能與胡椒愈傷組織不分化有關。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

Different small letters represent extremely significant?difference （P<0.05）.

2.2? 不同時期胡椒體細胞胚細胞分裂素類（CTK）含量變化

如圖4所示，在對不同發(fā)育時期異戊烯腺嘌呤（IP）進行測定發(fā)現(xiàn)，IP含量在H時期最高達6.21 ng/g，在P時期IP含量最低為0.01 ng/g。在體細胞胚發(fā)生后的T與Z時期的IP含量降低到0.03 ng/g，顯著低于不分化的Y時期。

在對不同發(fā)育時期順式玉米素（cZ）進行測定發(fā)現(xiàn)，cZ含量在Y時期最高達1.33 ng/g，其他時期的cZ含量都較低，為0.01 ng/g左右。

在同一時期的細胞分裂素類激素比較中，Y時期中的cZ含量最高;在P時期中的IP與cZ含量都接近于零;在體細胞胚發(fā)生的H、T與Z時期中的IP含量較高。由相關結(jié)果分析可知，cZ的存在可能與胡椒非胚性愈傷組織不分化有關，IP可能與胡椒體細胞胚發(fā)育有關。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

Different small letters represent extremely significant?difference （P<0.05）.

2.3? 不同時期胡椒體細胞胚茉莉酸類（JA）含量變化

如圖5所示，在對不同發(fā)育時期茉莉酸甲酯（ME-JA）進行測定發(fā)現(xiàn)，ME-JA含量在Y時期最高達0.23 ng/g，在體細胞胚開始發(fā)生的H、T與Z時期的ME-JA含量降低到0 ng/g，但在P時期ME-JA含量也有0.19 ng/g。ME-JA只存在還未開始分化的愈傷組織里。

在對不同發(fā)育時期茉莉酸（JA）進行測定發(fā)現(xiàn)，JA含量在Z時期最高達2.56 ng/g，在P時期JA含量最低為0 ng/g。在體細胞胚發(fā)生過程中的H、T與Z時期的JA含量逐漸升高，但三者的JA含量都顯著低于Y時期。

在同一時期的茉莉酸類激素比較中，Y時期中的JA含量最高;在P時期中的ME-JA含量較高;在體細胞胚發(fā)生的H、T與Z時期中的JA含量較高。由相關結(jié)果分析可知，JA可能與胡椒體細胞胚分化與發(fā)育有關，而ME-JA可能只與胡椒愈傷組織形成有關。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

Different small letters represent extremely significant?difference （P<0.05）.

2.4? 不同時期胡椒體細胞胚水楊酸（SA）與脫落酸（ABA）含量變化

如圖6所示，在對不同發(fā)育時期水楊酸（SA）進行測定發(fā)現(xiàn)，SA含量在H時期最高達48.10 ng/g，在Y時期SA含量最低為15.27 ng/g。在體細胞胚開始發(fā)生的H、T與Z時期的SA含量先降后升，由T時期的18.13 ng/g升到Z時期的25.17 ng/g，且在P時期的SA含量也有19.17 ng/g。

在對不同發(fā)育時期脫落酸（ABA）進行測定發(fā)現(xiàn)，ABA含量在H時期最高達17.47 ng/g，在P時期ABA含量最低為0.17 ng/g。在體細胞胚發(fā)生后的T與Z時期的ABA含量基本不變，保持在5.80 ng/g，但二者的ABA含量都顯著低于Y時期的11.03 ng/g。由相關結(jié)果分析可知，SA與ABA含量的升高可能與胡椒愈傷組織開始分化體細胞胚有關，但SA與ABA可能不利于胡椒體細胞胚進一步發(fā)育。

2.5? 不同時期胡椒體細胞胚GAS類含量變化

如圖7所示，在對不同發(fā)育時期赤霉素類（GAS）進行測定發(fā)現(xiàn)，GA3含量只存在P時期達0.26 ng/g，其他時候不含GA3含量。GA9在Y時期達到最高值0.31 ng/g，并顯著高于體細胞胚開始發(fā)生的H與T時期含量。GA15在Y時期達

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

Different small letters represent extremely significant?difference （P<0.05）.

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

Different small letters represent extremely significant?difference （P<0.05）.

到最高值0.40 ng/g，在P時期含量最低為0.05 ng/g，在體細胞胚發(fā)生的H、T、Z時期呈先升后降，但各時期的GA15含量差異不顯著。GA20存在Y、H、T與Z時期，其中H時期達最高值0.45 ng/g，其余時期含量都在0.35 ng/g左右，且各時期的GA20含量差異不顯著。由相關結(jié)果分析可知，不同的GAS對胡椒體細胞胚發(fā)生影響不同，GA3可能與胡椒胚性愈傷組織形成有關，而高含量的GA9可能與胡椒非胚性愈傷組織形成有關，GA15與GA20可能在胡椒體細胞胚發(fā)生中起到輔助作用。

2.6? 不同時期胡椒體細胞胚中不同內(nèi)源激素含量的相關性分析

由表2可知，IAA與ICA、IP、SA、ABA均呈極顯著正相關性（r = 0.815**，r = 0.948**，r = 0.932**，r = 0.809**），與ME-JA有顯著負相關性（r =?0.537*）;IBA與cZ、ME-JA均有極顯著正相關性（r = 0.983**，r = 0.659**）;ICA與IP、SA、ABA有極顯著正相關性（r =0.905**，r = 0.749**，r = 0.865**）;IP與SA、ABA有極顯著正相關性（r = 0.916**，r = 0.907**）;cZ與ME-JA有極顯著正相關性（r =0.708**）;ME-JA與SA有顯著正相關（r = 0.542*）;SA與ABA有極顯著正相關性（r = 0.702**）;GA3與ABA有極顯著負相關性（r = ?0.670**），與ME-JA有顯著負相關性（r = ?0.638*）;GA9與IBA、cZ有極顯著正相關性（r = 0.945**，r = 0.945**），與JA有顯著正相關性（r = 0.614*）;GA15與IBA、GA9有顯著正相關性（r = 0.514*，r = 0.556**）。由相關系數(shù)分析得知，IAA、ICA、IP、SA與ABA可能對胡椒體細胞胚發(fā)生的作用相同且密切相關，ME-JA、IBA與cZ的作用與IAA等相反，GAS中的GA3與GA9、GA15的作用不一致。

3? 討論

3.1? 胡椒不同時期體細胞胚中的內(nèi)源激素變化

植物激素對植物細胞的增殖分裂、結(jié)構分化與生命代謝等方面都具有重要的調(diào)節(jié)作用，而植

物體細胞胚發(fā)生與內(nèi)源激素含量的變化密切相關，各種激素對植物體細胞胚胎發(fā)生有不同的影響[14-15]。在對龍眼體細胞胚發(fā)生過程中內(nèi)源激素變化的研究中發(fā)現(xiàn)，IAA在胚性愈傷組織中含量大于非胚性愈傷組織，并在球形胚時期到達高峰[6]。在本研究中，通過對胡椒體細胞胚發(fā)生不同時期的內(nèi)源激素研究發(fā)現(xiàn)，生長素類激素中，IAA可

能與胡椒體細胞胚的發(fā)生與發(fā)育有關，而IBA與ICA的高含量可能與抑制胡椒體細胞胚發(fā)生有關，與龍眼體細胞胚發(fā)生的研究結(jié)果相似。另外在對荔枝品種‘下番枝體細胞胚發(fā)生過程中內(nèi)源激素的研究中發(fā)現(xiàn)IAA含量上升對荔枝早期體胚發(fā)生具有促進作用[7]，而本研究結(jié)果與其IAA對荔枝體胚發(fā)生的促進作用一致。

同樣也在對荔枝品種‘下番枝體胚發(fā)生的研究中發(fā)現(xiàn)，在球形胚時期荔枝的細胞分裂素含量極低，需要添加額外的細胞分裂素，促進其體胚發(fā)生。本研究中，細胞分裂素類中的IP與cZ都對胡椒體細胞胚發(fā)生的作用不大，其中高含量的cZ可能與非胚性愈傷組織產(chǎn)生有關，這與對荔枝品種‘下番枝體胚發(fā)生的研究結(jié)果不一致?；蛟S胡椒體細胞胚發(fā)生不需要額外細胞分裂素。

JA與SA同為抗逆性植物激素[16-17]，但其中尚無JA在體細胞胚發(fā)生中作用的研究報道。在對西洋參[18]、胡蘿卜[19]與蘇鐵[20]的體細胞胚發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)，通過添加適合濃度的外源SA，可以促進其體胚發(fā)生。在本研究中，SA對胡椒胚性愈傷組織產(chǎn)生與體細胞胚發(fā)生都有關，這與西洋參、胡蘿卜與蘇鐵的體細胞胚發(fā)生相關研究結(jié)果一致。

ABA在胡椒胚性愈傷組織開始分化成體細胞胚時期含量最高，可能與這一時期植物細胞發(fā)生重大變化有關。在對橡膠花藥[8]的不同類型愈傷組織中激素變化的研究中發(fā)現(xiàn)ABA在非胚性愈傷組織中含量最高，畸形胚中最低。而在本研究中，ABA在胡椒非胚性愈傷組織中含量很高，但在體細胞胚開始發(fā)生時含量最高，這與橡膠花藥不同類型愈傷組織中激素變化的研究結(jié)果相似。

GA3是廣泛分布于植物的一類重要生長調(diào)節(jié)劑，參與種子萌發(fā)，幼苗生長發(fā)育、果實成熟發(fā)育等重要的生理過程[21-22]。在大多數(shù)植物的體細胞胚發(fā)生研究中認為高含量的GA3對體細胞胚發(fā)生具有負作用[23]。GA3在胡椒不同時期體細胞胚中，無體細胞胚的GA3含量整體高于有體細胞胚的GA3含量，且GA3與ABA含量上升負相關，而ABA對胡椒體細胞胚發(fā)生有正相關，因此GA3可能對體細胞胚發(fā)生具有抑制作用。

通過本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)源激素與胡椒體細胞胚發(fā)生密切相關，且不同激素對胡椒體細胞胚發(fā)生作用不同。其中IAA與多數(shù)5種激素相關性強且含量變化顯著，可能對胡椒體細胞胚發(fā)生的作用最明顯，另外，SA與ABA在胡椒不同時期體細胞胚中含量水平都較高，而GA3、ME-JA與cZ只出現(xiàn)在胡椒愈傷組織時期。表明IAA、SA與ABA對胡椒體細胞胚發(fā)生密切相關，GA3、ME-JA與cZ對胡椒愈傷組織產(chǎn)生有作用。由此可見，胡椒體細胞胚不同時期中不同內(nèi)源激素的比例，對胡椒體細胞胚發(fā)生具有特定的調(diào)控作用。

3.2? 胡椒體細胞胚發(fā)生條件對內(nèi)源激素變化的影響

植物生長發(fā)育與內(nèi)源激素密切相關，而內(nèi)源激素變化易受外界添加物、光照光強、脅迫條件等因素影響[24-25]。靈發(fā)素（LFS）對半夏體細胞胚發(fā)生和發(fā)育過程中內(nèi)源激素IAA、ZR、ABA和GA3的調(diào)控起著重要作用[26]。在光、暗處理及不同濃度毒莠定（PIC）下對牡丹體細胞胚發(fā)生的內(nèi)源激素影響研究中發(fā)現(xiàn)，光/暗12 h/12 h、PIC 4.0 mg/L的條件下對胚性愈傷組織產(chǎn)生有促進作用，并且球形胚提前出現(xiàn)，其中IAA含量遠高于對照，且ABA/IAA和ABA/GA3均呈上升趨勢[27]。在筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，誘導胡椒胚性愈傷組織與體細胞胚較適宜的條件是無激素與暗培養(yǎng)，在體細胞胚開始發(fā)生后，再轉(zhuǎn)移到光培養(yǎng)中才能進一步發(fā)育分化成苗。這與本研究中，胚性愈傷組織的內(nèi)源激素中普遍含量都較低和體細胞胚發(fā)生與發(fā)育中部分激素水平升高的現(xiàn)象相對應。而根據(jù)本研究結(jié)果，光照培養(yǎng)后， IAA、SA與ABA含量的上升可能對胡椒體細胞胚發(fā)生具有促進作用，但仍需要研究驗證。今后應進一步明確內(nèi)源激素在胡椒體細胞胚發(fā)生中的作用機制，為探索激素調(diào)控胡椒體細胞胚發(fā)生提供試驗基礎。

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