陳慶狀 馬艷嬌 范儀圻 侯添志 肖曉丹

AD 主要導(dǎo)致認(rèn)知和記憶功能進(jìn)行性衰退［1］。線粒體Aβ 已被證明是AD 發(fā)病機(jī)制中必不可少的神經(jīng)毒性物質(zhì)。AD 患者和APP/PS1 小鼠的線粒體中Aβ的積累會導(dǎo)致線粒體呼吸鏈活性減弱［2］。ABAD 也稱為17β-HSD10,對維持線粒體能量產(chǎn)生的穩(wěn)定狀態(tài)起著至關(guān)重要的作用。然而,研究發(fā)現(xiàn)Aβ 和ABAD 形成的復(fù)合物會誘導(dǎo)ABAD 結(jié)構(gòu)異常,從而阻止ABAD與NAD+結(jié)合,導(dǎo)致ABAD 無法發(fā)揮酶促活性［3］。因此,Aβ-ABAD 復(fù)合物可加劇Aβ 誘導(dǎo)的線粒體和神經(jīng)元功能障礙［4］。HupA 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于癡呆相關(guān)的疾病,是一種具有疾病改善型的AD 治療藥物［5］。HupA 通過減少APP/PS1 小鼠腦內(nèi)Aβ 與ABAD 復(fù)合物的形成而改善腦細(xì)胞線粒體功能,從而降低Aβ 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用［6］。但HupA 是否可進(jìn)一步改善AD 小鼠的認(rèn)知和記憶功能尚不得而知。因此,本研究將HupA 腹腔注射6 個(gè)月后,觀察AD 模型小鼠的認(rèn)知和記憶功能改變情況,并進(jìn)一步闡明阻斷Aβ-ABAD復(fù)合物誘導(dǎo)的線粒體損傷是否在HupA 改善AD 小鼠認(rèn)知和記憶功能障礙中發(fā)揮作用,為拓展HupA 的臨床應(yīng)用提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性AD(APP/PS1)小鼠,體重20～ 30 g。

1.2 主要試劑及材料 ATP 試劑盒,ABAD、兔抗Aβ 免疫球蛋白(Ig)G 和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗,辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG。

1.3 主要方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 ①AD-HupA 組:月齡為2 個(gè)月的AD 小鼠每天腹腔注射HupA(0.1 mg/kg)持續(xù)6 個(gè)月；②WT-HupA 組:月齡為2 個(gè)月的WT 小鼠操作同“①”；③AD-溶媒組:月齡為2 個(gè)月的AD 小鼠每天腹腔注射生理鹽水持續(xù)6 個(gè)月；④WT-溶媒組:月齡為 2 個(gè)月的WT 小鼠操作同“③”；⑤AD-他克林組:月齡為2 個(gè)月的AD 小鼠每天腹腔注射他克林(0.5 mg/kg)持續(xù)6 個(gè)月［6］。

1.3.2 離散型腦細(xì)胞(dissociated brain cells,DBCs)的提取 小鼠斷頭取腦,大腦半球用預(yù)冷PBS洗滌,吹散,離心后棄上清。重懸上一步得到的細(xì)胞沉淀,離心后棄上清,重復(fù)上述操作2 次后,得離散型細(xì)胞。

1.3.3 ATP 水平檢測 收集每組DBCs 后,加入100 μl ATP 釋放劑,加入熒光素底物和熒光素酶避光孵育 10 min,Perkin Elmer 酶標(biāo)儀檢測生物發(fā)光強(qiáng)度［7］。

1.3.4 免疫共沉淀法檢測Aβ-ABAD 復(fù)合物蛋白水平 提取小鼠腦細(xì)胞線粒體,加入Tris 緩沖液,在4℃下14000×g 離心5 min。上清液加入兔抗Aβ IgG 一抗4℃孵育過夜,再加入蛋白質(zhì)A 瓊脂糖珠20℃孵育2 h。然后再進(jìn)行Western blot 操作。

1.3.5 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 小鼠給藥后進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)。訓(xùn)練試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行5 d,4 次/d。在第6 天的測試實(shí)驗(yàn)中,移除平臺,記錄小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)、在該象限中所花費(fèi)的總時(shí)間和每只小鼠速度。2 h后,更換平臺并評估動(dòng)物在90 s 內(nèi)找到平臺的能力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD 法)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HupA 改善AD 小鼠線粒體障礙 與WT 對照組相比,AD 組的ATP 水平顯著降低(P＜0.01),HupA 處理后可顯著逆轉(zhuǎn)AD 小鼠ATP 的下降趨勢(P＜0.01),但他克林沒有此效應(yīng)(P＞0.1)。見圖1A。

圖1A HupA 改善AD 小鼠線粒體障礙(n=4)

2.2 HupA 減少Aβ-ABAD 復(fù)合物水平 與WT 對照組相比,AD 小鼠Aβ-ABAD 復(fù)合物水平大幅升高(P＜0.001),經(jīng)HupA 治療后顯著降低了Aβ-ABAD 復(fù)合物的水平(P＜0.001)。然而,他克林治療組的Aβ-ABAD 復(fù)合物水平并未顯著降低(P＞0.1)。提示HupA與AD 小鼠大腦中線粒體Aβ-ABAD 復(fù)合物水平的降低有關(guān)。見圖1B。

圖1B HupA 減少Aβ-ABAD 復(fù)合物水平(n=4),aP＜0.01,bP＜0.01

2.3 HupA 改善AD 小鼠認(rèn)知和記憶障礙 與AD 組相比,HupA 處理的AD 小鼠穿越平臺次數(shù)和所在目的象限時(shí)間百分比有顯著性提高,表明HupA 可改善AD模型小鼠的認(rèn)知和記憶功能障礙。而他克林雖也可改善AD 小鼠的空間認(rèn)知和記憶能力,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 HupA 改善AD 小鼠認(rèn)知和記憶障礙()

3 討論

Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能障礙是引起AD 的主要病理機(jī)制［8］。Aβ 與ABAD 的結(jié)合會抑制ABAD 的酶活性,進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體ATP 產(chǎn)生不足［3,6］。本研究顯示,未經(jīng)HupA 處理的AD 小鼠的DBC 中ATP 水平顯著降低。而經(jīng)HupA 處理后,ATP水平明顯升高。提示HupA 對AD 小鼠腦細(xì)胞線粒體具有保護(hù)作用。但是,他克林組未發(fā)現(xiàn)對線粒體功能的保護(hù)作用。

AD 患者及AD 小鼠大腦中ABAD 蛋白表達(dá)明顯增加,ABAD 可加重AD 患者和AD 小鼠中Aβ 誘導(dǎo)的線粒體功能障礙［3,9］。本研究提示,AD 小鼠腦細(xì)胞中Aβ 和ABAD 的復(fù)合物形成水平顯著增加,而HupA顯著減少復(fù)合物的形成。這些結(jié)果表明,HupA 顯著降低AD 小鼠的ABAD 蛋白水平,從而降低Aβ-ABAD復(fù)合物的水平。

綜上結(jié)果提示,HupA 可通過減少Aβ-ABAD 復(fù)合物的形成改善AD 小鼠腦細(xì)胞線粒體損傷。

本研究進(jìn)一步采用Morris 實(shí)驗(yàn)檢測HupA 是否能改善AD 小鼠的認(rèn)知和記憶能力。結(jié)果提示,與WT小鼠相比,AD 小鼠的認(rèn)知和記憶能力顯著降低,而HupA 可明顯改善AD 小鼠的認(rèn)知和記憶能力。他克林組雖也能改善AD 小鼠的認(rèn)知和記憶能力,但統(tǒng)計(jì)學(xué)沒有顯著性差異。Liang 等［10］的研究也顯示他克林相對HupA 在改善AD 患者認(rèn)知功能方面并不具優(yōu)勢。但最近的研究表明,在抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)之前,HupA 已被證明可改善線粒體功能和記憶喪失［8］。這也與本研究的結(jié)果相符,相比他克林,HupA 除了具有AChE 抑制劑活性外,還能發(fā)揮線粒體保護(hù)作用。因此推測,HupA 減少Aβ 和ABAD 復(fù)合物誘導(dǎo)的線粒體功能障礙在減輕AD 小鼠的認(rèn)知和記憶功能障礙中起著不可或缺的作用。

總之,HupA 可通過減少Aβ 與ABAD 的結(jié)合來發(fā)揮線粒體保護(hù)作用,且極可能與進(jìn)一步改善AD 小鼠的認(rèn)知和記憶功能障礙有關(guān)。研究結(jié)果揭示了HupA在治療AD 中的獨(dú)特藥理作用機(jī)理,并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HupA 在AD 治療中的作用提供了一種新穎的方法。