張霜

B 族鏈球菌(GBS)即無乳鏈球菌主要定植于女性生殖道和消化道,是造成孕生婦圍生期感染的主要病原菌之一。GBS 可能會造成孕婦早產(chǎn)、胎膜早破,還可能傳染給胎兒,導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)感染,出現(xiàn)腦膜炎、敗血癥等嚴重并發(fā)癥［1］。因此做好GBS 定植的篩查,積極進行針對性的抗生素干預(yù),對于保障母嬰的生命安全有重要的意義。本次研究對于常規(guī)血瓊脂培養(yǎng)法、顯色培養(yǎng)法及PCR法篩查孕婦GBS的效果進行了比較,報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年3 月～2019 年12 月本院產(chǎn)科門診的715 例孕晚期孕婦作為研究對象。孕婦年齡22～45 歲,平均年齡(30.1±5.0)歲；其中初產(chǎn)婦 420 例(58.74%),經(jīng)產(chǎn)婦295 例(41.26%)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 選用ABI 公司的7500 RES-TIME 型熒光定量PCR 擴增儀、梅里埃公司的VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng),以及其配套的GP 鑒定卡。

1.2.2 試劑 梅里埃公司的GBS 分群凝集試劑盒、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基。泰普生物科學(xué)公司的GBS 核酸檢測試劑盒和GBS 顯色培養(yǎng)基。金黃色葡萄球菌(ATCC25923)和無乳鏈球菌(ATCC12386)的質(zhì)控菌株由中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心提供。選擇性T-H 增菌肉湯由英國OXOID 公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 對所有孕婦均采集其陰道和肛周分泌物標本。陰道和肛周分泌物樣本采集的位置在陰道口1/3 處、括約肌上面3 cm 左右處。使用無菌拭子,小心旋轉(zhuǎn)1 圈取得分泌物樣本。

1.3.2 樣本檢測 采集樣本分別采用常規(guī)細胞培養(yǎng)法、顯色培養(yǎng)法及熒光PCR 法進行GBS 篩查,并以T-H 肉湯增菌培養(yǎng)法為參考標準。①常規(guī)血瓊脂培養(yǎng)法：將標本接種至哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上,分區(qū)劃線后,放入CO2培養(yǎng)箱,在35℃,5%～6% CO2下孵育24 h。取出培養(yǎng)皿,通過觀察菌落的形態(tài)特征和β 溶血特性進行尋找GBS 菌落。選取β 溶血灰白色,且革蘭染色為陽性的可疑菌落,進行進一步的觸酶試驗、CAMP 試驗和溶血試驗,以篩選GBS 菌落。對于篩選出的GBS 菌落采用VITEK 2 Compact 細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進行最終的鑒定和確認。②顯色培養(yǎng)法：將標本接種至顯色培養(yǎng)基上,分區(qū)劃線,置入CO2培養(yǎng)箱,以同樣條件孵育24 h。孵育完成后,挑選紅色的可疑菌落進行CAMP 試驗,對于CAMP 試驗陽性的菌落采用VITEK 2 Compact 細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進行最終的鑒定和確認。③熒光PCR 法：將標本加入緩沖液高速震蕩搖勻制備成標本懸浮液。離心5 min (13000 r/min)取沉淀物。加入緩沖液再次以同樣轉(zhuǎn)速離心5 min,保留沉淀物。加入100 μl 的TE 緩沖液進行重懸,并加入內(nèi)參物。高速震蕩5 min 后先干浴120 s,再進行冰浴300 s,最后再進行離心60 s 留取上清液。取5 μl 上清液作為PCR 檢測樣本加入反應(yīng)管中進行PCR 擴增,按照GBS 核酸檢測試劑盒的說明書進行結(jié)果的判斷。④T-H 肉湯增菌培養(yǎng)法：將取的拭子標本加入T-H 增菌肉湯中,充分混勻后,放入CO2培養(yǎng)箱,在35℃,CO2濃度為5%～6%的條件下進行孵育24 h左右。然后接種至血平板上,尋找可疑菌落,并對可疑菌落進行處理,處理方法與常規(guī)血瓊脂培養(yǎng)法相同。

1.4 觀察指標 以T-H 肉湯增菌培養(yǎng)法為參考標準,比較不同檢測方法篩查GBS 的靈敏度、特異度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

715 例孕晚期孕婦經(jīng)T-H 肉湯增菌培養(yǎng)法檢測陽性68 例,陽性率為9.51%。以T-H 肉湯增菌培養(yǎng)法為參考標準,常規(guī)細菌培養(yǎng)法檢測的GBS 的靈敏度、特異度分別為64.71%、99.85%；顯色培養(yǎng)法分別為91.18%、99.69%,熒光PCR 法分別為95.59%、99.85%。顯色培養(yǎng)法及熒光PCR 法篩查GBS 的靈敏度均高于常規(guī)細菌培養(yǎng)法,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 不同檢測方法的GBS 篩查結(jié)果比較(n)

3 討論

常規(guī)血瓊脂平板細菌培養(yǎng)是目前GBS 篩查的常用手段。但是其對于菌落的最低檢測量要求較高,而樣本中細菌種類過多,未經(jīng)挑選進行培養(yǎng),一些腸桿菌繁殖迅速,會限制GBS 的生長,使得GBS 的菌量未達到最低檢測量,容易發(fā)生漏檢［2］。且常規(guī)細胞培養(yǎng)的耗時長,需孵育過夜,且培養(yǎng)結(jié)果容易受到標本采集和運送過程影響。而顯色培養(yǎng)法利用GBS 在厭氧條件下能合成橙紅色的類胡蘿卜素,從而形成橙紅色菌落進行GBS 的篩選,再對特征性顏色的菌落進行鑒定和檢驗,具有較高的靈敏度。不過一些鏈球菌如化膿鏈球菌等在同樣條件下會形成類似顏色的色素,另外還有較少比例的GBS 不會產(chǎn)生類胡蘿卜素,約在5%左右,故還是存在一定的漏檢或誤檢［3］,本次研究中即有2 例化膿鏈球菌被誤檢為GBS。而熒光PCR 是針對GBS 設(shè)計特異性引物,在體外通過PCR 反應(yīng)擴增得到特定的DNA 片段,加以熒光染料標記探針,從而檢測GBS 的核酸片段。熒光PCR 檢測的靈敏度極佳,陽性率高,且檢測迅速。賈忠蘭等［4］的研究結(jié)果顯示,熒光PCR 篩查GBS 的靈敏度最佳。本次研究對于常規(guī)血瓊脂培養(yǎng)法、顯色培養(yǎng)法及熒光PCR 法三種方法篩查孕婦GBS 的效果進行了比較,結(jié)果顯示顯色培養(yǎng)法及熒光PCR 法的GBS 篩查靈敏度高于常規(guī)細菌培養(yǎng)法(P＜0.05)。這與既往高坎坎等［5］的研究一致,熒光PCR 法和顯色培養(yǎng)法在孕婦GBS 篩查中的應(yīng)用價值較高,而常規(guī)細胞培養(yǎng)的篩查效果不夠理想。熒光PCR法檢測迅速,靈敏性好,但成本較高,而顯色培養(yǎng)法操作簡單,成本低,且在篩選純化GBS 后,還可進一步進行藥敏試驗但相對耗時,臨床可根據(jù)具體情況選用。

綜上所述,熒光PCR 法和顯色培養(yǎng)法在孕婦GBS篩查中的應(yīng)用價值較好,臨床可根據(jù)具體情況選用。