藍蔚青，張 溪，趙盼盼，仇煒麟，迪麗菲拉·庫爾班，謝 晶

（1.上海海洋大學食品學院// 2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心// 3.上海海洋大學食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，上海 201306）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）又名太平洋白蝦、南美白對蝦，是全球重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟蝦類[1]，其味道鮮美，體內(nèi)富含多不飽和脂肪酸與氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)[2]。據(jù)2020 年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒[3]顯示，我國凡納濱對蝦海水養(yǎng)殖產(chǎn)量為111.75 萬t，占蝦類海水養(yǎng)殖產(chǎn)量77%以上。但蝦類等水產(chǎn)品在流通期間由于受微生物與內(nèi)源酶影響，極易發(fā)生腐敗，因而采用合適的處理手段延長其貨架期意義重大。目前，蝦類的常用保鮮方法有物理保鮮、化學保鮮與生物保鮮等[4]。近年來，隨著消費者對食品安全重視程度的逐年增加，生物保鮮由于其綠色安全而受到研究人員的關(guān)注。

生物保鮮劑，又稱為天然保鮮劑，其取材廣泛，是從動、植物和微生物中提取的安全、健康、無毒，具有保鮮效果的一類食品添加劑。其中，植物提取物具有抗氧化和抗菌活性，作為潛在的天然添加劑越來越受到人們重視。迷迭香（Rosmarinus officinalis）屬唇形科草本植物，含有鼠尾草酸，迷迭香醇、迷迭香醌、迷迭香二酚、肉桂醇與肉桂酸等多種抗氧化成分[5]。迷迭香提取物的抗氧化和抗菌活性主要歸因于肌酸和肌醇，其含有酚類二萜化合物，可穩(wěn)定不飽和脂肪酸，延緩其降解，因此被應用于水產(chǎn)品和肉制品中[6]。其中，王強等[7]研究發(fā)現(xiàn)迷迭香提取物對鲊廣椒肉丸中的微生物生長有較好的抑制作用；張楠楠等[8]采用2 g/L 迷迭香提取物與 1 g/L ε-聚賴氨酸復配處理大黃魚（Pseudosciaena crocea），能使其冰藏貨架期由6～9 d 延至13～ 15 d。目前，生物保鮮劑用于蝦類保鮮研究主要集中在葡萄籽提取物[9]與石榴皮提取物[10]等，而迷迭香提取物用于凡納濱對蝦保鮮研究報道尚少?；诖耍狙芯恐饕骄坎煌瑵舛让缘闾崛∥飳Ψ布{濱對蝦冷藏期間品質(zhì)變化影響，通過菌落總數(shù)、理化（pH 值、總揮發(fā)性鹽基氮TVB-N值、硫代巴比妥酸TBA 值、質(zhì)構(gòu)分析TPA 值）與蛋白特性（總巰基含量、蛋白熒光強度）指標，結(jié)合色差、黑變指數(shù)與感官分析，綜合評價其冷藏期間的品質(zhì)變化，以期為生物保鮮劑在蝦類水產(chǎn)品中的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要藥品試劑

三氯乙酸、乙醇、氯化鈉、氧化鎂，購于國藥集團化學試劑有限公司；平板計數(shù)瓊脂，購于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；總巰基測定試劑盒，購于南京建成生物科技有限公司；硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、三羥甲基氨基甲烷、順丁烯二酸，購于生工生物工程（上海）股份有限公司等，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設備

Kjeltec8400 型凱氏定氮儀，瑞典FOSS 公司；H-2050R 型臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；TA.XT Plus 質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System 公司。

1.3 原料處理

凡納濱對蝦（L.vannamei）購于上海市浦東新區(qū)尚優(yōu)鮮生超市，選取體長（14±1）cm、體質(zhì)量（16±1）g，體表無損且大小均一的活蝦。將蝦置于充氧氣運輸箱中保活，30 min 內(nèi)運輸至實驗室。用碎冰使其休克失活，清水洗凈瀝干后隨機分成4組，分別用無菌水（CON），質(zhì)量分數(shù)2.0%、4.0%、6.0%迷迭香提取物溶液浸漬處理10 min，蝦水質(zhì)量比為1∶2，自然瀝干15 min 后，裝入保鮮袋于（4±1）℃冰箱中，每2 d 測定各項指標。

1.4 實驗方法

1.4.1菌落總數(shù)（Total Viable Counts，TVC）參考GB 4789.2-2016[11]方法測定菌落總數(shù)。稱取5 g蝦肉放入盛有45 mL 質(zhì)量分數(shù)0.85%無菌生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，均質(zhì)后梯度稀釋。采用傾注倒平板法，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后計數(shù)，結(jié)果以菌落總數(shù)對數(shù)值表示。

1.4.2理化指標

1.4.2.1pH 值 參考GB 5009.237-2016[12]方法測定pH 值。將蝦肉與蒸餾水按質(zhì)量比1∶9 混勻后，靜置30 min，用pH 計測定。

1.4.2.2總揮發(fā)性鹽基氮（Total volatile basic nitrogen，TVB-N）據(jù)GB 5009.228-2016[13]中的自動凱氏定氮儀法，測定各組樣品貯藏期間的TVB-N 值。

1.4.2.3硫代巴比妥酸（Thiobarbituric acid，TBA）參考Ge 等[14]方法，稱取5 g 蝦肉，將其與體積分數(shù)20%三氯乙酸溶液25 mL 混合后均質(zhì)1 min，8000 r/min 離心10 min，取上清液定容至50 mL 后搖勻。取5 mL 上述溶液，與5 mL 0.02 mol/L 硫代巴比妥酸液混勻后，沸水反應20 min，流水冷卻至室溫，吸取顯色溶液測定其在532 nm 處的光密度值D，按照TBA 值=7.8×D計算TBA 值，單位為mg/kg。

1.4.2.4質(zhì)構(gòu)分析（Texture Profile Analysis，TPA）參考Liu 等[15]方法稍作修改，取蝦腹部第二節(jié)肌肉，采用直徑6 mm 的平底圓柱形探頭如下：測試前速率為4 mm/s，測試時速率為1 mm/s，測試后速率為5 mm/s，壓縮形變率為50%，兩次下壓間隔時間為5.0 s，觸發(fā)值大小為15 g。記錄每組樣品在不同貯藏時間下的硬度值與彈性值。

1.4.3蛋白特性

1.4.3.1總巰基含量 按總巰基含量測定試劑盒說明書，采用分光光度法測定412 nm 處光密度值。分子消光系數(shù)取13 600 L/(mol·cm)。

1.4.3.2內(nèi)源熒光強度 參考Li 等[16]的方法提取肌原纖維蛋白。取2 g 蝦肉與20 mL 緩沖液（20 mmol/L Tris-maleate，pH 7.0，0.05 mol/L KCl）勻漿，以10 000 r/min、4 ℃離心15 min，留下層沉淀與20 mL 緩沖液（20 mmol/L Tris-maleate，pH 7.0，0.6 mol/L KCl）均質(zhì)，在4 ℃條件下靜置提取1 h。將混合物于10 000 r/min 4 ℃離心15 min，上清液為肌原纖維蛋白溶液，并存放在0～ 4 ℃條件下1 h內(nèi)備用。提取肌原纖維蛋白溶液進行內(nèi)源熒光高速掃描檢測，采集參數(shù)如下：激發(fā)波長為295 nm；發(fā)射波長為300～ 400 nm；掃描速度為1 200 nm/min，狹縫寬度為5 nm。

1.4.4色差 根據(jù)汪春玲等[17]法，用白色校準板校準色差計后，測第二腹節(jié)蝦肉表面的亮度值L*、紅度值a*與黃度值b*。

1.4.5黑變指數(shù) 根據(jù)Kim 等[18]法，采用表1 的評分標準，由6 名經(jīng)過專業(yè)培訓的人員分別對不同組別樣品的黑變情況予以評分。其分值越小，代表其新鮮度越高。

表1 凡納濱對蝦黑變評分標準Table 1 Evaluation criteria for Litopenaeus vannamei

1.4.6感官評價 參考Azizi-lalabadi 等[19]法采用9分制評定凡納濱對蝦的總體可接受度。由6 名經(jīng)過專業(yè)訓練的人員組成感官評定小組，整體評分根據(jù)色澤、氣味與質(zhì)地等方面對樣品予以感官評價。將樣品分為四個等級：為壞或不可接受（1～ 3 分）、好（4～ 6 分）、非常好（7～ 8 分）、優(yōu)秀（9 分）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復3 次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS17.0 軟件，作圖采用Origin85 軟件，采用單因素方差分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)

凡納濱對蝦在不同迷迭香提取物作用下，其冷藏過程中的菌落總數(shù)變化如圖1 所示。

由圖1 可知，CON 組和RE 處理組的菌落總數(shù)隨著貯藏時間的增加呈上升趨勢。CON 組的菌落總數(shù)初始對數(shù)值為2.67±0.09，經(jīng)過整個貯藏期后菌落總數(shù)對數(shù)值達到7.56±0.08。與CON 組貯藏8 d菌落總數(shù)相比，RE 處理組菌落總數(shù)均顯著降低（P＜0.05），降低數(shù)在0.41～ 1.75。而RE1 組和RE2樣品的菌落總數(shù)在整個貯藏期內(nèi)，菌落總數(shù)對數(shù)值始終未超過7。其中以RE3 的菌落總數(shù)值最低，可見，質(zhì)量分數(shù)4.0%與6.0%迷迭香提取物浸漬處理對凡納濱對蝦貯藏過程的菌落總數(shù)有明顯的抑制作用。該結(jié)果與Nawaz 等[20]研究的迷迭香提取物對印鯪（Cirrhinus mrigala）保鮮結(jié)果變化一致。Hussein 等[21]報道迷迭香提取物可延緩雞肉片冷藏期間嗜冷菌生長和生物胺的升高。

圖1 不同濃度迷迭香提取物對凡納濱對蝦冷藏期間菌落總數(shù)變化影響Fig.1 Effects of different treatments on TVC of white leg shrimp (Litopenaeus vannamei) during refrigerated storage

2.2 pH 值和TVB-N 值

蝦肉中的總揮發(fā)性鹽基氮是指蛋白質(zhì)在微生物和酶作用下分解為氨和胺類等堿性化合物[22]。不同濃度迷迭香提取物對凡納濱對蝦冷藏期間pH 值和TVB-N 值變化影響如圖2 所示。

由圖2A 可知，各組的pH 值隨著貯藏時間的延長呈上升趨勢，可能與揮發(fā)性堿性化合物的積累有關(guān)[23]。與CON 組相比，RE2 和RE3 組在貯藏初期的pH 值增加較緩。Gao 等[24]研究發(fā)現(xiàn)迷迭香提取物可減緩雞胸肉貯藏期間pH 值上升，這與本研究結(jié)果一致。這可能與迷迭香提取物抑制腐敗菌生長，減少胺類物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)；另一方面原因是迷迭香提取物中含有鼠尾草酸、迷迭香酸、咖啡酸、熊果酸等酚酸類化合物，對pH 值升高有較好的抑制作用[25]。

從圖2B 可知，隨著冷藏時間的延長，各處理組的TVB-N 值呈增加趨勢。貯藏2 d，無菌水與RE 處理組的TVB-N 值相近，分別為（11.15±0.73）、（10.01±0.55）、(8.98±0.23)、（8.76±0.49）mg/100g。從4 d 起，各處理組樣品TVB-N 值差異性顯著（P＜0.05），各組蝦樣中TVB-N 值的增長速率從大到小依次為CON 組＞RE1 組＞RE2 組＞RE3 組。對照組樣品的TVB-N 值上升速度明顯快于RE 處理組。樣品在貯藏6 d 時，CON 組的TVB-N含量值為（32.66±0.36）mg/100g，已超過腐敗限值（30 mg/100 g），而RE1，RE2 和RE3 組的TVB-N值分別為（27.78±0.55）、（24.05±0.51）、（21.90±0.66）mg/100 g。結(jié)果表明浸漬質(zhì)量分數(shù)4%和6%的迷迭香提取物保鮮效果較好，這是因為迷迭香提取物處理能在一定程度上抑制蝦肉中的微生物生長，降低蛋白質(zhì)分解速率，減少含氮類化合物累積。

圖2 不同濃度迷迭香提取物對凡納濱對蝦冷藏期間pH 值和TVB-N 值變化影響Fig.2 Effects of different treatments on pH and TVB-N value of Litopenaeus vannamei during refrigerated storage

2.3 TBA 值和總巰基含量

蝦肉中的不飽和脂肪酸氧化是導致異味產(chǎn)生的主要原因之一。TBA 值是評價脂肪氧化程度的重要指標，氧化程度越高，表明產(chǎn)生的醛酮類等氧化產(chǎn)物越多。

圖3A 可知，不同迷迭香提取物濃度處理的凡納濱對蝦TBA 值總體呈上升趨勢。貯藏前期，不同處理方式對凡納濱對蝦TBA 值差異不顯著（P＞0.05），隨著貯藏時間的延長，其差異顯著（P＜0.05）。CON 組TBA 初始值為0.029 mg/kg，貯藏8 d 時為0.69 mg/kg，而RE1、RE2 和RE3 組分別比CON 組TBA 值低15.9%、24.6%和20.3%。這可能是因為迷迭香提取物的抗氧化性，降低了脂肪氧化速率，減少不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生。Jafari等[26]研究發(fā)現(xiàn)迷迭香提取物中的鼠尾草酸可提供酚基氫，導致形成穩(wěn)定的最終產(chǎn)物并改變自由基鏈。由于迷迭香提取物中含鼠尾草酸、迷迭香酚等具有較強的螯合金屬離子能力，能有效穩(wěn)定自由基，從而抑制蝦肉的脂肪氧化[27]。

圖3 不同濃度迷迭香提取物對凡納濱對蝦冷藏期間TBA值和總巰基含量變化影響Fig.3 Effects of different treatments on TBA valueand total sulfhydryl content of white leg shrimp (Litopenaeus vannamei)during refrigerated storage

總巰基含量是反映蛋白被氧化程度的指標之一。圖3B 可知，在冷藏8 d 期間，各組樣品總巰基含量不斷下降，這是由于蛋白分子內(nèi)部的活性巰基被暴露而氧化導致。隨著迷迭香提取物濃度的增加而下降速度減慢（P＜ 0.05），表明迷迭香提取物延緩蝦肉肌原纖維蛋白氧化。0 d，凡納濱對蝦的總巰基質(zhì)量摩爾濃度為（2.15±0.04）μmol/g，RE1、RE2和RE3 組樣品冷藏8 d 分別降低至（1.12±0.07）、（1.24±0.05）、（1.32±0.03）和（1.42±0.04）μmol/g。Nie 等[28]探究冷藏期間海鱸魚（Lateolabrax japonicas）肌肉中總巰基的含量變化與本研究結(jié)果一致，可能歸因于巰基氧化為二硫鍵，導致總巰基含量減少。CON 組樣品與處理組相比，其差異顯著（P＜0.05）。由此可見，迷迭香提取物可抑制樣品貯藏期間的蛋白質(zhì)氧化。

2.4 質(zhì)構(gòu)分析

如圖4 所示，不同處理凡納濱對蝦在冷藏期間硬度呈下降趨勢，8 d 時，與新鮮樣品的初始硬度值（897.12±8.72）相比（圖4A），CON、RE1、RE2 和RE3 組樣品的硬度分別降至新鮮樣品的28.01%、48.38%、52.24%和50.66%?？赡苁俏r肉中的蛋白質(zhì)降解和汁液損失導致肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)改變[29]。彈性表示蝦肉因外力作用而變形、撤外力后恢復的速率。各組樣品彈性值（圖4B）隨著冷藏時間的延長而逐漸減少，這是因為微生物和內(nèi)源性蛋白酶作用導致肌肉組織結(jié)構(gòu)韌性降低[30]。與CON 組相比，RE2 和RE3 組樣品下降幅度較小，這與Lan等[31]研究迷迭香提取物對冰藏大黃魚的彈性變化趨勢相一致。表明迷迭香提取物可延緩蝦肉中的蛋白質(zhì)降解速率，穩(wěn)定其肌肉組織結(jié)構(gòu)。

圖4 不同濃度迷迭香提取物對凡納濱對蝦冷藏期間硬度值和彈性值變化影響Fig.4 Effects of different treatments on hardness and springiness value of Litopenaeus vannamei during refrigerated storage

2.5 內(nèi)源熒光光譜

色氨酸殘基具有熒光特性，其吸收紫外光而發(fā)射的熒光對周圍微環(huán)境的極性非常敏感[32]。蛋白質(zhì)折疊時，色氨酸殘基位于蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水環(huán)境，被激發(fā)后發(fā)射較高的熒光強度；蛋白質(zhì)完全或部分展開時，當色氨酸殘基暴露于蛋白質(zhì)表面，被激發(fā)后熒光強度降低。因此，可監(jiān)測內(nèi)源熒光強度來研究蛋白構(gòu)象變化[33]。

由圖5 可知，新鮮樣品的熒光強度最高，發(fā)射波長為334 nm 處的熒光強度最大。隨著貯藏時間的延長，氨基酸的天然排列方式發(fā)生改變，內(nèi)源色氨酸殘基逐漸暴露于極性環(huán)境中，熒光強度下降。與CON 組相比，RE1、RE2 和RE3 組樣品的內(nèi)源熒光強度下降幅度較小，說明迷迭香提取物可維持樣品貯藏期間蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。Shi 等[34]研究發(fā)現(xiàn)迷迭香上釉提取物對泥蝦（Solenoceramelantho）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有保護作用。

圖5 不同濃度迷迭香提取物對凡納濱對蝦肌原纖維蛋白冷藏期間熒光強度變化影響Fig.5 Effects of different treatments on intrinsic fluorescence intensity (IFI) of myofibrillar proteins of white leg shrimp(Litopenaeus vannamei) during refrigerated storage.

2.6 色差

色澤是消費者肉眼評判水產(chǎn)品鮮度的直觀依據(jù)[35]。圖6 表示不同處理方式對冷藏凡納濱對蝦肌肉L*值、a*值和b*值變化影響。

由圖6A 可知，樣品的L*值隨著貯藏時間延長而降低，表明其肌肉亮度下降。與CON 組樣品相比，不同濃度迷迭香提取物處理能延緩L*值降低，較好穩(wěn)定其色澤，這與Huang 等[36]研究迷迭香提取物提高豬肉糜亮度一致。不同處理方式樣品a*值（圖6B）總體呈上升趨勢，可能是因為蝦體多酚氧化酶作用下導致其黑變，使蝦體色澤變深。CON 組a*值在貯藏末期達到正值，顯著高于RE 處理組。由此說明，迷迭香提取物能延緩樣品a*值升高，質(zhì)量分數(shù)4.0%和6.0%迷迭香提取物浸漬處理效果最佳。樣品b*值（圖6C）隨著貯藏時間的延長而上升，RE3 組由于提取物自身顏色影響，使其b*值升高明顯，而RE2 組樣品處理濃度較低，對蝦肉在貯藏期間的色澤無負面影響，能在延長其冷藏貨架期的同時，維持其體表色澤穩(wěn)定。

圖6 不同濃度迷迭香提取物對凡納濱對蝦冷藏期間色差變化影響Fig.6 Effects of different treatments on color difference of white leg shrimp (Litopenaeus vannamei) during refrigerated storage

2.7 黑變值和感官評分

由于多酚氧化酶催化用，無色酚類物質(zhì)被氧化為醌，發(fā)生一系列生化反應生成黑色物質(zhì)[37]。

如圖7A 所示，各組樣品在冷藏期間的黑變分值均顯著增加（P＜ 0.05）。與CON 組樣品相比，迷迭香提取物處理能延緩蝦體黑變。其中，RE2 和RE3 組樣品黑變評分顯著低于RE1 組。由圖可知，CON 和RE1 組的蝦樣頭胸部分別在2 d 和4 d 開始出現(xiàn)黑斑，而RE2 和RE3 組在6 d 出現(xiàn)黑斑。

如圖7B 所示，凡納濱對蝦在貯藏期間感官評分逐漸降低，表明凡納濱對蝦的品質(zhì)不斷下降。RE2組樣品在貯藏期間的感官分值高于其他處理組，與對照組相比差異性顯著（P＜0.05），且在外觀，風味方面表現(xiàn)出更好的品質(zhì)特征。由此表明，在提取物質(zhì)量分數(shù)為4%時，其感官評分最佳，如濃度升高則其感官分值相應降低。Hao 等[38]發(fā)現(xiàn)，添加迷迭香提取物處理能有效維持鮑魚（Haliotis discusHannai Ino）良好的感官品質(zhì)。

圖7 不同濃度迷迭香提取物對凡納濱對蝦冷藏期間黑變指數(shù)和感官變化影響Fig.7 Effects of different treatments on melanosis and sensory score of Litopenaeus vannamei during refrigerated storage

3 結(jié)論

迷迭香提取物浸漬處理能明顯抑制凡納濱對蝦冷藏期間的微生物生長速度，減緩其pH 值、TVB-N 值與TBA 值的上升速率，使蝦肉保持良好的硬度與彈性值，降低蛋白質(zhì)氧化速率，維持樣品貯藏期間蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，保持體表色澤穩(wěn)定。其中，以浸漬質(zhì)量分數(shù)4.0%迷迭香提取物保鮮作用效果最佳。與對照組相比，凡納濱對蝦經(jīng)該濃度浸漬處理后，能使其冷藏貨架期延長2～ 3 d。