姚仲偉 蘇淑芬 李美錦 鄒新飛 鄭愛(ài)妮 鄭亦男

廣東省婦幼保健院PICU，廣州 511400

中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）感染性疾病是兒童時(shí)期嚴(yán)重的疾病，常因臨床癥狀不典型、實(shí)驗(yàn)室診斷延誤導(dǎo)致治療不及時(shí)，病死率高，尤其是細(xì)菌性腦膜炎患者的病死率一直居高不下，且存活患者中相當(dāng)一部分遺留后遺癥［1-3］。明確CNS感染的病原體對(duì)于降低CNS感染的病死率、縮短住院時(shí)間、減少后遺癥都有重要的作用。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法以腦脊液涂片、細(xì)菌培養(yǎng)和抗原檢測(cè)為主，部分實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展分子生物學(xué)檢測(cè)。但這些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法總體上陽(yáng)性率偏低，超過(guò)50%的CNS感染性疾病最終都無(wú)法明確病原診斷［4-6］。而病原學(xué)診斷對(duì)CNS感染的診斷及治療至關(guān)重要，故尋找一種在特異性與靈敏度方面均優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的新型檢測(cè)方法意義重大。

宏基因組測(cè)序技術(shù)（metagenomic next generation sequencing，mNGS）作為一種快速、低成本和高通量的病原體DNA測(cè)序技術(shù)，已用于CNS各類(lèi)病原體感染檢測(cè)，對(duì)比傳統(tǒng)檢測(cè)方法具有高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性［7］。本研究對(duì)兩組分別行腦脊液常規(guī)培養(yǎng)聯(lián)合熒光定量PCR（qPCR）和mNGS檢測(cè)的疑似CNS感染患者的相關(guān)結(jié)果進(jìn)行分析，以明確mNGS在CNS感染性疾病病原檢測(cè)方面的優(yōu)勢(shì)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年4月至2020年1月入住本院PICU以發(fā)熱、抽搐、嘔吐、嗜睡等為首發(fā)癥狀，考慮CNS感染性疾病的患兒55例為觀察組，收集患兒腦脊液行mNGS檢測(cè)。選擇2018年5月至2019年4月入住本院PICU的疑似CNS感染并進(jìn)行了腦脊液常規(guī)培養(yǎng)和qPCR檢測(cè)的患兒51例為對(duì)照組。qPCR檢測(cè)病毒指標(biāo)包括：巨細(xì)胞病毒-DNA、EB病毒-DNA、單純皰疹病毒II型-DNA、單純皰疹病毒I型-DNA、人腸道病毒-RNA。觀察組年齡5個(gè)月～9歲，對(duì)照組年齡1個(gè)月～11歲。

1.2 方法 觀察組行mNGS檢測(cè)，每例患兒采集3～5 ml腦脊液樣本，無(wú)菌封存，于-20℃儲(chǔ)存或干冰冷鏈運(yùn)送至廣州微遠(yuǎn)基因生物公司完成檢測(cè)，包括DNA和RNA兩部分的監(jiān)測(cè)。RNA部分進(jìn)行了宿主細(xì)胞核糖體RNA的去除步驟以提高RNA病毒的檢測(cè)靈敏度。mNGS技術(shù)通過(guò)臨床樣本總核酸提取后，隨機(jī)引物建庫(kù)，PCR擴(kuò)增出該樣本中的所有微生物，最后通過(guò)對(duì)擴(kuò)增片段的序列測(cè)定和比對(duì)鑒定具體的微生物種類(lèi)，然后再扣除正常人群中出現(xiàn)的微生物群落背景，來(lái)找到所檢測(cè)臨床標(biāo)本中可能致病的微生物。對(duì)照組行常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)：收集患兒2～3 ml腦脊液樣本，送至本院微生物室，將其接種在厭氧菌、需氧菌培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，控制二氧化碳濃度在6%～11%，溫度控制在35～36℃，18～24 h后進(jìn)行觀察，分析是否有增菌液渾濁現(xiàn)象或菌膜組織，提取培養(yǎng)液或菌膜接種在血平板中，進(jìn)行病原體的分離培養(yǎng)，然后開(kāi)展離心處理工作，圖片干燥之后，進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.3 觀察指標(biāo) 統(tǒng)計(jì)觀察組和對(duì)照組病原檢測(cè)結(jié)果與兩組患兒的住院時(shí)間，了解兩種檢測(cè)方法對(duì)住院時(shí)間的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，兩組間采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種方法病原體檢出種類(lèi)的比較 在觀察組55例疑似CNS感染患兒中，24例患兒的腦脊液標(biāo)本的高通量測(cè)序結(jié)果為陽(yáng)性，靈敏度為43.6%，其中11例（20.0%）檢測(cè)為細(xì)菌，2例（3.6%）檢測(cè)為真菌，9例（16.4%）檢測(cè)為病毒，2例（3.6%）檢測(cè)為分枝桿菌。在病原菌檢測(cè)陽(yáng)性率上高于傳統(tǒng)方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

2.2 兩種方法住院時(shí)間的比較 106例疑似CNS感染患兒，55例患兒進(jìn)行mNGS檢測(cè)，住院時(shí)間為（17.19±13.3）d，51例患兒進(jìn)行傳統(tǒng)方法檢測(cè)，住院時(shí)間為（24.90±14.8）d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.825，P＝0.006）。

2.3 兩種方法檢測(cè)病原菌情況 在檢出的病原菌中，mNGS方法細(xì)菌檢測(cè)以肺炎鏈球菌最為常見(jiàn)（5/11），病毒以單純皰疹病毒6B型最為常見(jiàn)（3/9），真菌與分枝桿菌各2例；傳統(tǒng)方法細(xì)菌培養(yǎng)以大腸桿菌最為常見(jiàn)（3/6），未檢出真菌與分枝桿菌，見(jiàn)表2。

3 討 論

CNS感染性疾病是一種兇險(xiǎn)的神經(jīng)科疾病，致死、致殘率高，早診斷、早治療是臨床亟待解決的問(wèn)題。近年來(lái)mNGS在感染領(lǐng)域體現(xiàn)出的突出作用而倍受關(guān)注，不但在目前已知可導(dǎo)致CNS感染的病原體方面發(fā)揮重要的診斷價(jià)值，而且在罕見(jiàn)病原體和跨物種傳播病原體檢測(cè)方面也發(fā)揮了無(wú)可替代的作用［8-9］。2018年有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)NGS診斷結(jié)合分枝桿菌復(fù)合群導(dǎo)致CNS感染的病例，之后陸續(xù)有mNGS檢出腮腺炎病毒、EB病毒、布氏桿菌、李斯特菌、腦囊蟲(chóng)相關(guān)的腦炎或腦膜炎的報(bào)道。2017年，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院張文宏等用mNGS在1例眼內(nèi)炎患者的玻璃體中檢測(cè)到偽狂犬病毒，并且在血清中檢測(cè)到偽狂犬病毒的特異性抗體，首次在世界上證實(shí)了偽狂犬病毒的跨物種傳播。此后，國(guó)內(nèi)有報(bào)道應(yīng)用mNGS診斷偽狂犬病毒性腦炎。本文1例mNGS檢測(cè)到腦脊液狂犬病毒，并經(jīng)廣東省疾病控制中心檢測(cè)證實(shí)為狂犬病毒陽(yáng)性，更進(jìn)一步證實(shí)了mNGS可以幫助病毒跨物種傳播檢出［10-16］。另外2例患者檢測(cè)到分枝桿菌，與臨床相符，經(jīng)及時(shí)專(zhuān)科治療后預(yù)后良好，可見(jiàn)其對(duì)特殊病原體、罕見(jiàn)病原體的檢測(cè)具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)，且為解決了臨床需求。

表1 兩種方法對(duì)疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患兒病原體檢出種類(lèi)比較[例（%）]

表2 兩種方法對(duì)疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患兒病原菌檢出情況（例）

在常見(jiàn)的細(xì)菌與病毒感染方面，兩種方法檢測(cè)結(jié)果符合中國(guó)兒童CNS感染致病菌的分布特點(diǎn)，但mNGS總的陽(yáng)性率高于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)和qPCR方法，且時(shí)效性更高，統(tǒng)計(jì)mNGS組患者的住院時(shí)間明顯短于對(duì)照組，55例患兒進(jìn)行mNGS檢測(cè)，住院時(shí)間為（17.19±13.3）d，51例患兒進(jìn)行傳統(tǒng)方法檢測(cè)，住院時(shí)間為（24.90±14.8）d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。故認(rèn)為mNGS可以使CNS感染性疾病患者獲益。

綜上所述，mNGS在腦脊液病原檢測(cè)方面較傳統(tǒng)的檢測(cè)方法更容易檢測(cè)到致病病原，包括罕見(jiàn)病原體，為治療贏得了時(shí)間窗，及時(shí)控制病情，縮短恢復(fù)時(shí)間，進(jìn)而改善預(yù)后，縮短住院時(shí)間，故mNGS可以為CNS感染性疾病的診治提供可靠有效的依據(jù)，有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

利益沖突：作者已申明文章無(wú)相關(guān)利益沖突。