侯智勇，劉陽

(四川旅游學(xué)院，成都 610100)

醬香在我國已有上千年歷史，因其香味獨特、應(yīng)用廣泛、獨具魅力而受到大眾喜愛，同時其產(chǎn)香機理及風(fēng)味成分復(fù)雜，使得眾多研究者致力于醬香風(fēng)味成分的研究[1-4]。對于產(chǎn)醬香微生物已有些報道，許多研究結(jié)果顯示芽孢桿菌與產(chǎn)醬香風(fēng)味關(guān)聯(lián)度比較大[5-6]，這些微生物的代謝活動與發(fā)酵過程中物理化學(xué)反應(yīng)的相互重迭作用，最終形成了醬香型白酒中一系列特殊的風(fēng)味物質(zhì)[7]。高溫大曲中的微生物對醬香風(fēng)味的形成尤為重要。羅建超等[8]曾從茅臺酒的大曲中分離出產(chǎn)醬香芽孢桿菌并初步探析其代謝產(chǎn)香；黃永光等[9]也從醬香型白酒生產(chǎn)制曲、堆積酒醅和發(fā)酵期酒醅中分離出地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌，并詳述了三類產(chǎn)香芽孢桿菌發(fā)酵代謝產(chǎn)香的特征性成分、特征性酶、產(chǎn)香過程風(fēng)味的特征性變化和群體微生物發(fā)酵機制?？梢姡瑢Ω邷卮笄形⑸锏难芯?，特別是芽孢桿菌的深入研究分析，有利于揭示醬香的形成機制。

本研究從醬香型白酒大曲中分離得到產(chǎn)醬香風(fēng)味的菌株，分析其發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物，跟蹤檢測代謝過程中總酸、氨基酸態(tài)氮、還原糖的變化過程，并應(yīng)用固相微萃取及氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測其發(fā)酵后的揮發(fā)性物質(zhì)，進而對產(chǎn)醬香芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物進行研究，為找出醬香的主體香分提供了參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種來源

實驗菌株：產(chǎn)醬香芽孢桿菌(從四川某酒廠產(chǎn)醬香高溫大曲中篩得)。

1.1.2 主要儀器

SYQ-DSX-280B型高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；QYC-2102C型搖床 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；6890N-5979B型氣相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、瓊脂22 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃，0.1 MPa，滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：小麥150 g，一半打碎，另一半完整混勻后于150 mL蒸餾水中煮25 min，以100 g重量分裝于錐形瓶中，121 ℃滅菌30 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化

采用無菌操作將3株純種菌株分別接種在斜面培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.2 產(chǎn)醬香菌株固體發(fā)酵

用無菌生理鹽水制成菌懸液，以2%接種量加入至發(fā)酵培養(yǎng)基中，共計3組平行實驗。每隔24 h觀察發(fā)酵情況，待發(fā)酵144 h完成后，對每個菌株產(chǎn)醬香情況做感官鑒定，根據(jù)產(chǎn)香能力分為：無、+、++、+++、 ++++ 5個等級，檢查培養(yǎng)基的產(chǎn)香情況、褐變情況以及培養(yǎng)基粘性，并做好記錄。

1.2.3 總酸含量的測定[10]

1.2.3.1 測定方法

分別取發(fā)酵時間24，48，72，96，120，144 h的樣品10.0 g于研缽中，加入10.0 mL蒸餾水研磨均勻，定容后過濾，用氫氧化鈉標準液滴定，記下消耗氫氧化鈉標準液的體積，計算總酸含量。

1.2.3.2 結(jié)果計算

總酸度/(mol/mL)=(c×V×K)/V0。

式中：c為氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/mL；V為滴定所消耗的標準堿液的體積，mL；V0為滴定時吸取的樣液體積，mL；K為換算系數(shù)。

1.2.4 氨基酸態(tài)氮的測定1.2.4.1 測定方法

采用甲醛法檢測樣品中的氨基酸態(tài)氮，根據(jù)消耗氫氧化鈉標準液的量，計算出氨基酸態(tài)氮含量。

1.2.4.2 結(jié)果計算

氨基酸態(tài)氮/%=[(V1-V2)×c×0.014×100]/(m×10/100)。

式中：V1為稀釋液在加入甲醛后滴定至pH 9.20所用氫氧化鈉標準溶液的體積；V2為空白滴定在加入甲醛后滴定至pH 9.20所用氫氧化鈉標準溶液的體積；c為氫氧化鈉標準溶液的濃度；m為樣品的質(zhì)量；0.014為氮的毫摩爾質(zhì)量。

1.2.5 還原糖的測定[11]

1.2.5.1 樣品處理

分別取發(fā)酵時間24，48，72，96，120，144 h的樣品10.0 g，加入100 mL蒸餾水，攪拌20 min，靜置10 min，取上清液即為樣品液。

1.2.5.2 試樣測定

采用斐林試劑鑒定還原糖的方法，直接滴定樣品中的還原糖，直至藍色剛好褪去為終點，記錄樣液消耗體積，同法平行操作3份，得出平均消耗體積。

1.2.5.3 結(jié)果計算

η/%=250M2/(V0×V×1000)。

式中：η為樣品中還原糖的含量(以葡萄糖計)；M2為10 mL堿性酒石酸銅溶液(甲、乙液各5 mL)相當于還原糖(以葡萄糖計)的質(zhì)量；V0為樣品體積；V為測定時平均消耗樣品溶液體積；250為樣品溶液總體積。

1.2.6 GC-MS檢測發(fā)酵產(chǎn)物[12]

1.2.6.1 樣品預(yù)處理

分別取未接種菌株的空白發(fā)酵培養(yǎng)基、3種菌株各自發(fā)酵完成后的樣品5 g于頂空瓶中平衡10 min后吸附20 min，將萃取頭移入氣相色譜的高溫汽化室中解吸5 min，進行GC-MS分析。

1.2.6.2 GC-MS條件

色譜、質(zhì)譜條件以及定性與定量分析方法參照《柑橘果皮中生香酵母的篩選及揮發(fā)性香氣成分分析》中的檢測條件和方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵后感官分析

發(fā)酵后觀察小麥固體發(fā)酵培養(yǎng)基褐變、粘稠情況以及生香情況，前48 h有豬肉香味，略帶氨味，到72 h有微弱的醬香味，氨氣味消失，到96 h醬香味更突出，到120 h醬香味非常突出，144 h后醬香味濃郁，見表1。

表1 各菌株發(fā)酵144 h后培養(yǎng)基特征與產(chǎn)醬香情況

2.2 總酸含量測定

本次實驗采用食品中總酸測定的普遍方法，即電位滴定法作為樣品總酸測定的方法，計算總酸的含量，結(jié)果見圖1。

圖1 發(fā)酵過程中總酸的變化

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間的增加，總酸含量也在不斷增加，且都在發(fā)酵72 h后總酸突然增大，發(fā)酵后期總酸增速小，基本平穩(wěn)略呈下降趨勢。分析此變化過程，芽孢桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量有機酸，致使發(fā)酵產(chǎn)物中總酸含量增加，尤其在發(fā)酵第3天，發(fā)酵溫度升高后明顯增加，發(fā)酵后期一些堿性物質(zhì)的生成導(dǎo)致總酸增速放慢，酸度有所下降。有研究表明，產(chǎn)醬香芽孢桿菌通常在高溫下能更好地產(chǎn)香，其與美拉德反應(yīng)有關(guān)，而產(chǎn)醬香芽孢桿菌的酸度突然增加也在發(fā)酵溫度升高時，與生香情況一致。因此，酸度的變化與醬香的生香情況可能有密切關(guān)聯(lián)。

2.3 氨基酸態(tài)氮的測定

氨基酸態(tài)氮含量的測定采用甲醛法，通過計算可得到樣品中氨基酸態(tài)氮的含量，結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的變化

由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的增加，氨基酸態(tài)氮含量不斷增加，芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶，蛋白酶能將蛋白質(zhì)水解為氨基酸，隨著發(fā)酵時間的推移，氨基酸態(tài)氮含量持續(xù)上升。在發(fā)酵過程中，蛋白質(zhì)分解速度與酶的活力、蛋白質(zhì)含量有密切關(guān)系，至發(fā)酵結(jié)束時氨基酸態(tài)氮含量達到最大。氨基酸態(tài)氮含量變化體現(xiàn)了游離氨基酸含量的逐漸增加，而游離氨基酸的含量與醬香食品的風(fēng)味密切相關(guān)。

2.4 還原糖的測定

用直接滴定法測定食品中還原糖的含量，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵過程中還原糖的變化

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的增加，還原糖的含量在不斷減少，期間，芽孢桿菌將還原糖分解利用供其生長繁殖，最終發(fā)酵樣品中的還原糖經(jīng)過呼吸作用被全部分解利用，而經(jīng)過微生物的糖代謝途徑，更易產(chǎn)生多種中間代謝產(chǎn)物及最終代謝產(chǎn)物，進而為醬香風(fēng)味提供了支撐。

2.5 GC-MS檢測發(fā)酵產(chǎn)物

分別檢測未接種菌株的空白發(fā)酵培養(yǎng)基、3種菌株各自發(fā)酵144 h后的揮發(fā)性物質(zhì)，得到各樣品的總離子流圖譜，見圖4～圖7。對總離子流圖中各數(shù)據(jù)進行分析，得到各樣品中揮發(fā)性香氣成分及相對含量，見表2。

圖4 空白組香氣成分圖譜

圖5 Q1香氣成分圖譜

圖6 Q2香氣成分圖譜

圖7 Q5香氣成分圖譜

表2 4種樣品揮發(fā)性香氣成分

由表2可知，3株菌株產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)有相同的，也有各自獨特的。Q1產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)最多，達到12種，Q2為9種，Q5為10種。Q1吡嗪相對含量為43.18%，Q2吡嗪相對含量為50.46%，Q5吡嗪相對含量為45.96%，且Q1、Q2 產(chǎn)生的2,3,5,6-四甲基吡嗪相對含量較高，而Q5產(chǎn)生的2,5-二甲基吡嗪相對含量較高。吡嗪含量高低以及所含種類差異是導(dǎo)致所產(chǎn)醬香味不同的原因。

3 結(jié)論與討論

醬香型白酒的主體香氣成分一直是白酒行業(yè)的研究熱點，到目前為止，關(guān)于醬香型白酒的特征香氣成分在學(xué)術(shù)界仍沒有定論。醬香主體香成分的不確定使得研究思路從源頭上被限制了。因此，從產(chǎn)醬香細菌的角度來看，分析醬香型白酒的主要呈香物質(zhì)及其形成機制值得進一步深入研究。

本文以小麥為發(fā)酵培養(yǎng)基，跟蹤檢測3株產(chǎn)醬香菌株在發(fā)酵過程中總酸、氨基酸態(tài)氮、還原糖的變化，得到其總酸含量是一個先增后降的變化過程，氨基酸態(tài)氮是一個連續(xù)增加的過程，而還原糖則是一個連續(xù)降低的過程。用固相微萃取及氣質(zhì)聯(lián)用法檢測3株菌株發(fā)酵后的揮發(fā)性物質(zhì)，結(jié)果顯示：其均有高含量、種類不同的吡嗪，以此可為確定產(chǎn)醬香主體成分提供參考。