朱鵬程, 張 倩, 卞金輝, 章 輝, 倪布清, 邵永豐

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院, 1. 心臟大血管外科, 2. 泌尿外科, 江蘇 南京, 210029)

二葉式主動脈瓣(BAV)畸形是最常見的先天性心臟病類型，在普通人群中的發(fā)病率為0.5%～2.0%, 男、女患者比例約為3∶1[1]。與常見的三葉式主動脈瓣(TAV)相比, BAV患者更易出現(xiàn)主動脈瓣鈣化并導致主動脈瓣狹窄，具有發(fā)病更早、進展更快、病死率更高等特點。此外, BAV最嚴重且最致命的并發(fā)癥是主動脈擴張及主動脈夾層，且主動脈擴張可呈現(xiàn)出發(fā)病早、持續(xù)進展等特點[2]。BAV所導致的一系列癥狀常出現(xiàn)在患者成年后，提示此病的防治應著重于早診斷、積極預防各種并發(fā)癥，并密切監(jiān)測瓣膜病變的進展情況。

目前的統(tǒng)計數(shù)據(jù)[3]顯示, BAV的發(fā)病呈現(xiàn)一定的家族聚集傾向，BAV患者及其一級親屬發(fā)病率為24%，遠高于普通人群的發(fā)病率，提示BAV具有較強的遺傳傾向。盡管如此, BAV的發(fā)病并不符合孟德爾的遺傳定律，該病的發(fā)生并不是簡單的單基因遺傳模式，而男性發(fā)病率高于女性則提示該病還與X染色體相關。目前, BAV的發(fā)病機制尚未明確，只能認為BAV是多種基因突變且與X染色體相關的疾病，而不同的環(huán)境危險因素和BAV瓣膜形態(tài)學的不同分型又導致了特殊的血流動力學分布，使得該病的進展呈現(xiàn)較強的異質性。本研究收集Gene Expression Omnibus (GEO)數(shù)據(jù)庫的相關數(shù)據(jù)，比較并篩選鈣化的BAV瓣膜數(shù)據(jù)與正常的TAV瓣膜數(shù)據(jù)的差異基因(DEGs)，探討B(tài)AV鈣化的關鍵基因(hub基因)和關鍵通路，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究的數(shù)據(jù)來源于GEO數(shù)據(jù)庫，通過GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE83543數(shù)據(jù)矩陣、探針文件GPL10558及對應的臨床信息。數(shù)據(jù)處理主要采用Perl(V5.28.1)軟件, R(The R Project for Statistical Computing)軟件用于數(shù)據(jù)篩選及數(shù)據(jù)可視化操作, FunRich軟件進行富集分析及預測miRNA, Cytoscape軟件構建蛋白互作(PPI)網絡及miRNA-mRNA調控網絡。

1.2 研究方法

1.2.1 原始數(shù)據(jù)的處理: 將GSE83453數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)進行分組，其中鈣化BAV組共10個樣，正常的TAV組共8個樣。通過探針文件GPL10558將原始數(shù)據(jù)中的“ID-REF”轉換為“Gene Symbol”。使用R軟件的“l(fā)imma”包篩選出DEGs, 篩選標準為adj.Pvalue<0.05和|logFC|>1。使用R軟件將DEGs進行可視化處理，繪制熱圖及火山圖。

1.2.2 GO富集分析: 使用R軟件的“clusterprofiler”“org. Hs. eg. db”“enrichplot”“ggplot2”R包對DEGs進行GO富集分析。GO富集分析結果用R軟件繪制成氣泡圖。上述步驟涉及的R包通過https: //bioconductor. org. 網址下載安裝。

1.2.3 KEGG富集分析: KEGG富集分析通過R軟件的“enrichKEGG”命令對DEGs進行富集分析。富集分析結果由R軟件繪制為條形圖。

1.2.4 PPI網絡構建: 從STRING數(shù)據(jù)庫搜索DEGs間的相互作用關系，將PPI關系導入Cytoscape構建PPI網絡。

1.2.5 篩選hub基因: 根據(jù)PPI使用Degree算法將DEGs排序，選擇前10個基因作為hub基因。

1.2.6 預測hub基因的miRNA: 分別采用miRwalk數(shù)據(jù)庫及FunRich軟件預測hub基因對應的miRNA, 將2組miRNA取交集，獲得hub基因對應的miRNA。

1.2.7 構建miRNA-mRNA調控網絡圖: 根據(jù)此前的數(shù)據(jù)，整理hub基因及預測出的miRAN的對應關系，采用Cytoscape軟件構建出miRNA-mRNA調控網絡圖。

2 結 果

2.1 DEGs

從數(shù)據(jù)集GSE83453中共篩選出DEGs 126個，其中上調基因85個，下調基因41個，DEGs的結果見圖1。

A: 熱圖; B: 火山圖。紅色代表上調，綠色代表下調。

2.2 GO富集分析及KEGG富集分析

對篩選出的126個DEGs進行GO注釋分析，發(fā)現(xiàn)DEGs涉及的生物過程(BP)主要富集在細胞外基質組織、細胞外結構組織、白細胞遷移及酸性化學反應相關的過程中; 在細胞成分(CC)方面, DEGs主要參與含膠原蛋白的細胞外基質的構成; 從分子功能(MF)方面來看, DEGs主要參與細胞外基質結構的構成。GO分析的可視化結果見圖2。

KEGG富集分析結果顯示, DEGs主要涉及的通路有PI3K-Akt信號通路、人類乳頭瘤病毒感染通路、細胞外基質受體相互作用通路、局灶黏附通路等。KEGG分析的可視化結果見圖3。GO富集分析及KEGG富集分析數(shù)據(jù)見表1。

表1 DEGs的GO及KEGG富集分析結果(部分)

2.3 hub基因

根據(jù)PPI，通過Degree算法將所有的DEGs排序，前10位的DEGs為hub基因，即COL1A1、MMP9、COL1A2、COL3A1、SPP1、THBS2、SERPINE1、COL4A1、COL5A2、COL4A2。DEGs的PPI網絡見圖4。

圖2 DEGs的GO富集分析氣泡圖

圖3 DEGs的KEGG富集分析條形圖

圖4 DEGs的PPI網絡圖

2.4 預測hub基因的miRNAs

將miRwalk數(shù)據(jù)庫及FunRich軟件預測出的miRNAs取交集，共獲得12個miRNA，即hsa-let-7d-5p、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-338-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-6088、hsa-miR-181c-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-145-5p, 繪制的韋恩圖見圖5。根據(jù)miRNA和mRNA的相互對應關系，構建出miRNA-mRNA調控網絡，見圖6。

圖5 miRWalk及FunRich預測出的miRNA的韋恩圖

圖6 預測的miRNA和hub基因構成的miRNA-mRNA調控網絡

2.5 對DEGs及hub基因的驗證

本課題組從GEO數(shù)據(jù)庫獲取另一組主動脈瓣的測序數(shù)據(jù)(GSE51472), 該數(shù)據(jù)集有正常及鈣化的主動脈瓣膜組織。從該數(shù)據(jù)集共篩選出672個DEGs, 將其與GSE83453數(shù)據(jù)集的DEGs取交集，共有34個相同的DEGs, 其中包括2個hub基因，韋恩圖見圖7，具體數(shù)據(jù)見表2。

圖7 GSE83453、GSE51472的DEGs及hub基因的韋恩圖

表2 GSE83453、GSE51472的DEGs及hub基因的交集

3 討 論

本研究通過對GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE83453數(shù)據(jù)集進行差異分析，篩選出鈣化的BAV與正常的主動脈瓣的DEGs共126個。GO富集分析顯示, DEGs主要參與細胞外基質組織、細胞外結構組織等生物過程，與含膠原蛋白的細胞外基質構成的細胞成分相關，其主要分子功能為細胞外基質結構的構成; KEGG富集分析顯示, DEGs主要參與PI3K-Akt信號通路、人類乳頭瘤病毒感染通路、細胞外基質受體相互作用通路、局灶黏附通路等。

根據(jù)富集情況可以推斷，細胞外基質組織、細胞外結構組織、含膠原蛋白的細胞外基質的構成、細胞外基質結構構成相關的通路發(fā)生改變是導致BAV瓣膜纖維化及進一步鈣化的直接原因。PI3K-Akt信號通路受抑制會導致細胞凋亡[4]，而細胞凋亡則可能是瓣膜出現(xiàn)病理改變的誘因。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫的檢索結果，局灶黏附通路相關的疾病包括家族性胸主動脈瘤和主動脈夾層，這個結果可以解釋BAV患者隨著年齡的增長，主動脈擴張的風險也隨之增高[5-6]; 細胞外基質受體相互作用通路相關的疾病有埃勒斯-當洛綜合征主動脈瓣型，其中第V亞型易合并先天性心臟病。

根據(jù)本研究的PPI結果, Degree算法獲取的10個hub基因分別為COL1A1、MMP9、COL1A2、COL3A1、SPP1、THBS2、SERPINE1、COL4A1、COL5A2、COL4A2。篩選出的10個hub基因中，有5個是COL家族基因:COL1A1和COL1A2組成Ⅰ型膠原的三螺旋結構，而膠原蛋白是骨基質中含量最豐富的蛋白質。研究[7-9]表明COL1A1/COL1A2突變與成骨不全癥及埃勒斯-當洛綜合征相關。成骨不全癥常伴有鈣磷代謝異常，這可能與BAV瓣膜的鈣化相關，而埃勒斯-當洛綜合征則易出現(xiàn)先天性心臟病。COL3A1突變的不同類型與血管性埃勒斯-當洛綜合征的表型和嚴重程度相關[10], 提示BAV患者主動脈病變的進程可能與COL3A1突變類型相關;COL4A1、COL4A2與血管及心臟發(fā)育畸形相關[11-12],COL4A2還對細胞外基質中的成骨分化有重要影響[13];COL5A2低表達更易出現(xiàn)主動脈瘤和夾層[14]，提示患者更易出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥。MMP9受抑制會促進細胞自噬[15], 而MMP9具有促進炎癥的功能[16]。SPP1對應的蛋白是骨橋蛋白，廣泛存在于細胞外基質中。骨橋蛋白與羥基磷灰石緊密結合，在細胞外基質中起重要作用。SPP1通過TGF-β信號通路促進纖維化[17], 這可能與BAV瓣膜病變早期的纖維化進程相關。目前,THBS2和SERPINE1均與腫瘤相關，與BAV鈣化的相關性暫時不確定。由此可見,COL1A1、COL1A2、COL4A2、SPP1可能與BAV瓣膜纖維化及進一步的鈣化相關，而COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL5A2與BAV患者主動脈并發(fā)癥的出現(xiàn)有關,MMP9基因的異常表達可能導致BAV瓣膜間質細胞自噬功能紊亂并促進炎癥反應。

此外，本課題組通過GSE51472數(shù)據(jù)集篩選出主動脈瓣鈣化相關的DEGs, 將其與GSE83453數(shù)據(jù)集的DEGs取交集，共有34個相同的DEGs, 包括2個hub基因，提示BAV瓣膜鈣化與TAV瓣膜鈣化可能有相似的通路，與之相關的hub基因是SPP1及MMP9。加劇BAV瓣膜病變并導致BAV相關并發(fā)癥的hub基因則可能是THBS2、COL5A2、COL4A1、COL1A1、COL3A1、COL4A2、COL1A2、SERPINE1。數(shù)據(jù)庫及軟件預測出的miRNA的交集共有12個。目前尚未找到與本研究相似的microRNA測序結果，所以預測出的miRNA還需要進一步驗證。