邱祥玉，謝星星，宋 娜，虎雅敏，關(guān)東龍，吳施國(guó)

(云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

“溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”是建立在云南吳氏扶陽(yáng)學(xué)術(shù)基礎(chǔ)上形成的一種治療原則和方法?！皽厣幏ā庇糜谥委煛瓣?yáng)衰陰盛，三陰臟寒”所致的三陰不升，人體氣機(jī)圓運(yùn)動(dòng)失常[1]。所謂“三陰”是指少陰腎、太陰脾和厥陰肝。三陰陽(yáng)氣的升發(fā)是整個(gè)人體氣機(jī)圓運(yùn)動(dòng)的運(yùn)行不息的關(guān)鍵，即名為“溫升三陰法”。在人體氣機(jī)圓運(yùn)動(dòng)中，有升才有降，有左升也需有右降，左升者，溫升三陰，右降者，肅降三陽(yáng)也。肝木、脾土，升于左，則胃土、肺金、膽火需降于右，升降循環(huán)，周流不息，是以整個(gè)氣機(jī)的圓運(yùn)動(dòng)得以正常地運(yùn)轉(zhuǎn)。吳榮祖教授在此理論原則之下：予以吳萸四逆湯“溫升三陰”，同時(shí)予以杏仁肅降肺金，厚樸肅降胃土，烏梅斂降膽火，三者共取“肅金”右降之意。同時(shí)吳榮祖教授認(rèn)為腎水寒則龍浮，相火不能潛藏其位，而浮越于上，故在溫升三陰的基礎(chǔ)上，需引火歸元。“黃柏、砂仁、甘草”三味藥為封髓丹，予之以取“秘陽(yáng)”之意。少陰陽(yáng)衰，火不暖土，脾失健運(yùn)，水濕不化，取苓桂術(shù)甘湯，燥土濕以助陽(yáng)左升。

原發(fā)性肝癌（又稱(chēng)肝細(xì)胞癌）是臨床中最常見(jiàn)且惡性程度較高的腫瘤之一，2020年我國(guó)肝癌發(fā)病人數(shù)達(dá)41萬(wàn)，死亡人數(shù)39萬(wàn)，死亡率高達(dá)95%，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的生命健康，手術(shù)、介入、放化療雖然有一定效果，但作用有限[2-3]。吳榮祖教授在臨床上運(yùn)用“溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”治療內(nèi)、外、婦、兒等疑難雜癥，取效頗佳。在治療肝癌上亦有較好的臨床療效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)平臺(tái)，分析藥物、疾病、靶點(diǎn)相互作用的機(jī)制，與中醫(yī)藥多靶點(diǎn)、多成分特點(diǎn)相一致，有利于中藥及中藥復(fù)方活性成分研究及機(jī)制探索[4-5]。本文基于“溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”的立法理論，取吳萸四逆湯溫升三陰，苓桂術(shù)甘湯溫陽(yáng)健脾，杏仁、厚樸、烏梅肅降肺胃、膽火以“肅金”，封髓丹“秘陽(yáng)”。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究在此大法下4個(gè)不同治法、方藥治療肝癌的藥效活性成分及可能的分子機(jī)制，為豐富此理論及后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供一定基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 活性成分的篩選 通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái) （TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）[6]查詢(xún)溫升三陰法對(duì)應(yīng)中藥（吳茱萸、附子、干姜、甘草），溫陽(yáng)化飲法對(duì)應(yīng)中藥（茯苓、桂枝、白術(shù)、甘草），肅金法對(duì)應(yīng)中藥（杏仁、厚樸、烏梅），秘陽(yáng)法對(duì)應(yīng)中藥（黃柏、砂仁、甘草）的化學(xué)成分，并進(jìn)一步收集各味中藥中口服生物利用度（OB≥30%）和藥物相似性（DL≥0.18）的活性成分，以納入后續(xù)研究。

1.2 活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)上述代表藥物活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息，以（Homo Sapiens）為檢索條件在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（UniProt）（https：//www.uniprot.org/）[7]進(jìn)行檢索，并將獲得的各個(gè)靶蛋白對(duì)應(yīng)的靶基因名換成對(duì)應(yīng)的基因Symbol。

1.3 肝癌疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 以英文“hepatocellular carcinoma”為 關(guān) 鍵 詞 分 別 在 GeneCards（http：//www.genecards/）[8]，OMIM（http：//omim.org/）[9]疾 病 數(shù)據(jù) 庫(kù)檢索肝癌靶點(diǎn)基因。

1.4 潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 運(yùn)用R語(yǔ)言對(duì)藥物成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射取交集，獲得“溫升三陰，肅金秘陽(yáng)”法治療肝癌的潛在作用靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建“中藥-化合物-治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 運(yùn)用Cytoscape3.7.2軟件對(duì)獲取的中藥有效成分靶點(diǎn)構(gòu)建“中藥-化合物-治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。采用Cyto Hubba插件進(jìn)一步分析該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成分。根據(jù)degree值選取網(wǎng)絡(luò)中排列15位的關(guān)鍵靶蛋白。

1.6 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn)分析將1.4所得交集基因?qū)нM(jìn)STRING（https：//string-db.org/）[10]數(shù)據(jù)分析平臺(tái)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析。選擇“Multiple proteins”作為分析模式，“Homo sapiens”用于生物種類(lèi)限制，同時(shí)選擇置信度為≥0.90進(jìn)一步篩選并隱藏孤立蛋白后構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并且利用R語(yǔ)言 4.0 軟件（https：//www.r-project.org/）對(duì)該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分析。

1.7 將4個(gè)治法下的藥物活性成分靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 用Cyto Hubba插件分析每個(gè)治法網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分，根據(jù)degree值選取網(wǎng)絡(luò)中排列前4的關(guān)鍵活性成分。

1.8 GO富集分析與KEGG富集分析 為了進(jìn)一步分析“溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”作用肝癌的可能機(jī)制，利用 DAVID 數(shù)據(jù) 庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/，Version 6.8）對(duì)210個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析，分別研究“溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”的主要生物功能與主要信號(hào)通路，并運(yùn)用Graphpad Prism8.0.1.244x64軟件對(duì)GO富集中的BP（生物進(jìn)程）和KEGG富集排名靠前的通路條目繪制成柱狀圖。

1.9 核心活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接 通過(guò)PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）下載關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白PDB ID并保存為pdb格式。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查找關(guān)鍵的有效成分信息，下載并保存為mol2格式。利用AutoDock Tools軟件將關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)完成分子對(duì)接，再通過(guò)pymol軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)有效成分檢索結(jié)果 根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)檢索并篩選得到253個(gè)有效成分（已刪除重復(fù)值）。其中溫升三陰法中148個(gè)有效成分，溫陽(yáng)健脾法中121個(gè)有效成分，肅降肺胃中29個(gè)有效成分，秘陽(yáng)法中139個(gè)有效成分。

2.2 肝癌潛在作用靶點(diǎn) 將藥物活性成分靶點(diǎn)基因229個(gè)，與疾病所得的相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得210個(gè)交集基因?yàn)椤皽厣?，肅金秘陽(yáng)法”治療肝癌的潛在作用靶點(diǎn)（見(jiàn)圖1）。

圖1 “溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”治療肝癌的靶點(diǎn)篩選圖

2.3 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)、關(guān)鍵基因分析

2.3.1 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將所得210個(gè)交集基因輸入STRING數(shù)據(jù)分析平臺(tái)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析。去除游離節(jié)點(diǎn)后，網(wǎng)絡(luò)中包含210個(gè)靶點(diǎn)，818條相互作用連線(xiàn)。

2.3.2 關(guān)鍵基因分析 為進(jìn)一步分析網(wǎng)絡(luò)中重要的核心靶點(diǎn)，利用R語(yǔ)言進(jìn)行篩選并根據(jù)度值將PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)繪制條形圖（見(jiàn)圖2）。在該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中其中度值較大的有STAT3（度值=31）、JUN（度值=29）、HSP90AA1（度值=25）、AKT1（度值=24）、MAKP1（度值=23）、MAKP3（度值=22），IL6（度值=18）等，它們與其他蛋白相互作用，在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。其中STAT3是度值最高的。

圖2 “溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”治療肝癌的PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶蛋白

2.4 “中藥-化合物-治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及分析將TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到253個(gè)有效成分及2.2中獲得的交集基因上傳至Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“中藥-化合物-治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖3）。

圖3 “溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”治療肝癌的“中藥-化合物-治療靶點(diǎn)”圖

在中藥-化合物-治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖上采用Cyto Hubba插件進(jìn)行分析，根據(jù)degree值選取網(wǎng)絡(luò)中排列前15位的關(guān)鍵靶點(diǎn)及關(guān)鍵活性成分（見(jiàn)表1）。

表1 “溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”治療肝癌中根據(jù)degree值排列的前15個(gè)化合物及靶點(diǎn)信息

2.5 “溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”下4個(gè)不同治法的關(guān)鍵活性成分及核心作用靶點(diǎn)

2.5.1 4個(gè)不同治法的關(guān)鍵活性成分 將“溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”4個(gè)不同治法下的藥物活性成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，用Cyto Hubba插件分析每個(gè)治法網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分，根據(jù)degree值分別選取各個(gè)網(wǎng)絡(luò)中排名前4位的關(guān)鍵活性成分（見(jiàn)表2-表5）。

表2 “溫升三陰”網(wǎng)絡(luò)中排名前4活性成分

表3 “溫陽(yáng)健脾”網(wǎng)絡(luò)中排名前4活性成分

表4 “肅金”網(wǎng)絡(luò)中排名前4的活性成分

表5 “秘陽(yáng)法”網(wǎng)絡(luò)中排名前4的活性成分

2.5.2 4個(gè)不同治法網(wǎng)絡(luò)下關(guān)鍵活性成分與靶點(diǎn)的關(guān)系 為了進(jìn)一步分析不同網(wǎng)絡(luò)中活性成分與靶點(diǎn)的關(guān)系，據(jù)Cyto Hubba插件中的degree值，取網(wǎng)絡(luò)中排名前12的核心信息。見(jiàn)圖4-圖7。

圖4 “溫升三陰法”網(wǎng)絡(luò)核心信息圖

圖5 “溫陽(yáng)健脾”網(wǎng)絡(luò)核心信息圖

圖6 “肅金”網(wǎng)絡(luò)核心信息圖

圖7 “秘陽(yáng)法”網(wǎng)絡(luò)核心信息圖

2.6 GO富集分析結(jié)果 將210個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析，其中RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化還原過(guò)程、藥物反應(yīng)、凋亡過(guò)程、炎癥反應(yīng)等是BP（生物進(jìn)程）分析中靠前的條目（見(jiàn)圖8）。提示“溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”在治療肝癌過(guò)程中通過(guò)參與調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程而發(fā)揮作用。

圖8 生物進(jìn)程（BP）富集分析圖

2.7 KEGG富集分析結(jié)果 通過(guò)KEGG通路富集分析，取“溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”顯著發(fā)揮影響的30條通路（見(jiàn)圖9）。結(jié)果顯示，其治療肝癌的機(jī)制主要涉及癌癥信號(hào)通路，PI3K/Akt信號(hào)通路、Hepatitis B信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路（見(jiàn)圖10）等。

圖9 KEGG信號(hào)通路富集圖

圖10 “溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”治療肝癌的PI3K/Akt信號(hào)通路圖

2.8 分子對(duì)接 在“溫升三陰，肅金秘法”的每個(gè)治法網(wǎng)絡(luò)中，MOL000098槲皮素（quercetin）為4個(gè)治法共同的活性成分也是預(yù)測(cè)靶點(diǎn)最多的。PTGS2為中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中degree值最大的靶點(diǎn)，同時(shí)也是四個(gè)治法網(wǎng)絡(luò)中排名靠前的核心靶點(diǎn)之一。因此，將二者選為分子對(duì)接的配體和受體。在PDB上檢索到PTGS2蛋白ID為5f19并下載其3D結(jié)構(gòu)。分子對(duì)接結(jié)果顯示槲皮素（quercetin）能穩(wěn)定地對(duì)接到PTGS2蛋白結(jié)構(gòu)5f19中，二者通過(guò)氨基酸殘基ARG-376，ASN-375相互發(fā)生作用。

圖11 核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接

3 討論

“溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”旨在恢復(fù)三陰臟寒所致的氣機(jī)圓運(yùn)失常。在此法中，運(yùn)轉(zhuǎn)的圓運(yùn)動(dòng)由“中土為軸，金木水火四象為輪”共同構(gòu)成。少陰腎為命門(mén)之火，其溫煦及氣化的作用是圓運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力，脾居中央是氣機(jī)升降之樞紐，脾陽(yáng)旺盛帶動(dòng)圓運(yùn)動(dòng)中軸的運(yùn)行，肝木升發(fā)標(biāo)著圓運(yùn)動(dòng)正常啟功、運(yùn)行[1]。四逆湯為補(bǔ)火助陽(yáng)，回陽(yáng)救逆之要方。吳榮祖教授認(rèn)為四逆湯中之附子主要用于升舉足少陰腎的陽(yáng)氣，作用十分重要；干姜用以溫中散寒，炙甘草用以補(bǔ)土以伏火，二藥共用，共同升舉足太陰陽(yáng)氣；吳茱萸，性溫，入肝經(jīng)，可通過(guò)溫散厥陰之寒達(dá)到升足厥陰肝陽(yáng)氣的作用。故“溫升三陰法”在治療上即體現(xiàn)在吳萸四逆湯上。彭子益所著的《圓運(yùn)動(dòng)之古中醫(yī)學(xué)》中云：“杏仁降肺金，開(kāi)斂結(jié)以降肺火，肺金降則相火便降”；“厚樸降膽理胃[11]”，說(shuō)明了杏仁、厚樸降肺金、胃土、膽火之用，在此取之以“肅金”之意?！端貑?wèn)·生氣通天論》云：“凡陰陽(yáng)之要，陽(yáng)密乃固”，只有腎中之水將命門(mén)之火潛藏其中才是實(shí)質(zhì)意義上的溫陽(yáng)[12]。故而吳榮祖教授認(rèn)為“溫陽(yáng)”需與“秘陽(yáng)”共舉，創(chuàng)“秘陽(yáng)法”?！懊仃?yáng)法”是針對(duì)“腎陽(yáng)虛衰，相火不密”而創(chuàng)以“溫水潛陽(yáng)，引火歸元”的一種治療方法[13]。此處取“黃柏、砂仁、甘草”三味藥。苓桂術(shù)甘湯可溫健中軸脾陽(yáng)以化飲，消散三陰臟寒停滯之寒飲[1]。故，藥物吳茱萸、附子、干姜、甘草、茯苓、白術(shù)、桂枝、杏仁、厚樸、烏梅、黃柏、砂仁共同構(gòu)建了“溫升三陰、肅金秘陽(yáng)”的大法。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)“溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”下各個(gè)不同治法抗肝癌作用進(jìn)行研究。全網(wǎng)絡(luò)共篩選出210個(gè)潛在治療靶點(diǎn)，利用STRING數(shù)據(jù)分析平臺(tái)得出 PPI靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)中 STAT3、JUN、HSP90AA1、AKT1是治療的核心靶點(diǎn)。STAT3作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員，在肝癌的炎癥微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。STAT3不僅參與肝癌的“炎癌轉(zhuǎn)化”，還可直接調(diào)控肝癌細(xì)胞內(nèi)與增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)，甚至與肝癌血管生成和免疫抑制有關(guān)[14-15]。STAT3被磷酸化后由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，通過(guò)對(duì) Mcl-1、Bcl-xl、c-myc和 Survivin基因表達(dá)的調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡[16]。c-Jun是細(xì)胞增殖過(guò)程中的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，可通過(guò)拮抗抑癌基因p53的活性，抑制肝癌細(xì)胞凋亡[17]。c-Jun在HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，有研究表明被敲除c-Jun的HBV小鼠，其腫瘤生長(zhǎng)受到了抑制[18]。熱休克蛋白90a（HSP90AA1）與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和血管生成有密切關(guān)系[19]。有研究發(fā)現(xiàn)[20]HSP90AA1的mRNA隨著肝癌TNM分期升高，其表達(dá)量隨之升高。AKT是本文PPI網(wǎng)絡(luò)中核心治療靶點(diǎn)之一，是PI3K/Akt信號(hào)通路中重要的下游靶標(biāo)，被磷酸化激活后的AKT是原發(fā)性肝癌預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素[21]。異常激活的AKT可存在于多種癌癥中，參與癌細(xì)胞的代謝，抑制癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖以及血管生成[22]。抑制AKT以及磷酸化AKT的表達(dá)水平有助于阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡[23]。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，槲皮素不僅是“溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”治療肝癌網(wǎng)絡(luò)中度值最高的也是4個(gè)治法下度值最高的活性成分。山柰酚是“溫升三陰”、“溫陽(yáng)健脾”以及“肅金”3個(gè)治法的共有關(guān)鍵成分。β-谷甾醇是“溫陽(yáng)健脾”、“肅金”以及“秘陽(yáng)”法的共有關(guān)鍵成分?，F(xiàn)代研究證明槲皮素是黃酮類(lèi)化合物的主要成分，對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤均有抑制作用。將槲皮素作用于人肝癌細(xì)胞株Hep3、Huh7、HepG2，其結(jié)果顯示槲皮素可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[24-25]。也可以降低自由基等損傷產(chǎn)物水平以發(fā)揮保肝作用[26]。有研究采用人肝癌LM3模型和裸鼠肝癌模型來(lái)觀(guān)察槲皮素對(duì)肝癌的作用，其結(jié)果表明槲皮素可抑制肝癌的發(fā)展，機(jī)制可能是通過(guò)作用于JAK2/STAT3信號(hào)通路以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、侵襲、遷移和自噬[27]。也有研究表明槲皮素可以抑制被生長(zhǎng)因子磷酸化的AKT，從而抑制AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞遷移[28]?！白允杉?xì)胞死亡”被認(rèn)為是持續(xù)的自噬激活而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。山柰酚可誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞非凋亡性死亡，其原因可能是誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬激活[29]。有實(shí)驗(yàn)證明，β－谷甾醇可以上調(diào)Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡[30]。此外，李慶勇[31]等人發(fā)現(xiàn)β－谷甾醇和豆甾醇具有抑制肝癌細(xì)胞SMMC－7721的增殖和誘導(dǎo)其凋亡的作用。

PTGS2是本文中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中degree值最大的靶標(biāo)，在分子對(duì)接中亦與槲皮素穩(wěn)定結(jié)合。PTGS2是PTGS誘導(dǎo)型基因中的一種，PTGS2也稱(chēng)環(huán)氧合酶2（COX-2）。有研究報(bào)道PTGS2在肝癌中高表達(dá)[32]，此外謝詠梅[33]等人，用western blot檢測(cè)肝炎、肝硬化、癌前病變及肝癌手術(shù)標(biāo)本的COX-2蛋白表達(dá)含量，其結(jié)果表明在肝硬化組織中COX-2呈現(xiàn)峰值，表明COX-2可能誘導(dǎo)肝硬化發(fā)生癌變。相關(guān)研究證明[34]美洛昔康作為一種選擇性環(huán)氧合酶2抑制劑，在體外和體內(nèi)均具有抗肝癌細(xì)胞增殖和抗血管生成的作用，其機(jī)制可能是通過(guò)降低HIF-1α的轉(zhuǎn)錄激活和表達(dá)從而抑制肝癌細(xì)胞血管生成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，“溫升三陰，肅金秘陽(yáng)法”具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療肝癌的作用模式，其作用的機(jī)制可能是通過(guò)槲皮素等多種有效成分作用于PTGS2、STAT3、AKT等蛋白調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以及調(diào)控多種生物學(xué)功能和PI3K/Akt、TNF等信號(hào)通路發(fā)揮抗肝癌作用。從分子水平揭示該治療大法治療肝癌的潛在化學(xué)成分及潛在作用機(jī)制，為下一步深入實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供一定的理論依據(jù)。