宋 健，孟凱強，張振華，張瑞凡，王紫慧，胥 冰，王 斌，沈舒文，楊燕燕

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000）

細菌感染是常見的微生物侵體類型，細菌感染可作為誘導(dǎo)因素，誘導(dǎo)其他疾病的發(fā)生發(fā)展，也可由其他疾病誘發(fā)。關(guān)于細菌感染的治療也是多種多樣的，常規(guī)的抗生素治療，噬菌體治療等。由于抗生素的濫用，抗生素耐藥性時常發(fā)生[1-2]，新的治療策略就顯得非常有意義。

越來越多的臨床數(shù)據(jù)證明傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下的遣方用藥在治療細菌感染方面療效顯著[3]，蘭艾雙香方是名老中醫(yī)沈舒文教授扎實的中醫(yī)理論和豐富中醫(yī)臨床經(jīng)驗的凝練，多年來一直作為治療細菌感染臨床基礎(chǔ)方，其組成有羌活、獨活、石菖蒲、藿香、蒼術(shù)、丁香、薄荷、貫眾、苦杏仁、佩蘭、艾葉，該方臨床中取得了良好的療效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（network pharmacology，NP）是以整體性和系統(tǒng)性為特性強調(diào)多成分、多靶點、多疾病之間的相互作用，通過使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可提高效率，降低開發(fā)成本，也適用于中醫(yī)藥的研究與開發(fā)。作為一項研究手段，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)迅速發(fā)展，形成了一系列成熟的數(shù)據(jù)方法、平臺和軟件，如中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）可對中藥成分進行篩選、獲取成分-靶點-疾病關(guān)系；Gene Cards，OMIM 和 DigSee 3個數(shù)據(jù)庫集成包括基因組、蛋白質(zhì)組、功能信息等資源；STRING數(shù)據(jù)庫可以預(yù)測藥物與蛋白質(zhì)之間相互作用；Cytoscape軟件用于分子互作網(wǎng)絡(luò)及生物途徑可視化；Metascape用于對靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析等。

1 資料和方法Data and methods

1.1 蘭艾雙香方活性成分的獲取及靶點篩選 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫收集蘭艾雙香方中羌活、獨活、石菖蒲、藿香、蒼術(shù)、丁香、薄荷、貫眾、苦杏仁、佩蘭和艾葉的化學(xué)成分[4-6]，以口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）為指標(biāo)進行篩選，確定其活性成分。通過TCMSP和Drug Bank數(shù)據(jù)庫查詢活性成分相對應(yīng)的靶標(biāo)蛋白，并利用Unitprot數(shù)據(jù)庫查詢靶標(biāo)蛋白對應(yīng)的基因名稱，篩選人類的靶點蛋白，最終整理得到蘭艾雙香方的活性成分及其對應(yīng)靶點。

1.2 細菌感染靶點篩選預(yù)測 利用Gene Cards，OMIM和DigSee 3個數(shù)據(jù)庫，以“bacterial infection”為關(guān)鍵詞，對細菌感染相關(guān)靶點進行檢索及篩選，將3個數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)果合并，刪除重復(fù)項后得到細菌感染的相關(guān)靶標(biāo)信息。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 利用jvenn平臺做出韋恩圖將所得藥物活性成分靶點與細菌感染疾病靶點相映射，得到蘭艾雙香方治療細菌感染的預(yù)測靶點。將交集得到的靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”相互作用網(wǎng)絡(luò)，并用Cytoscape 3.8.0軟件中的CytoNCA插件對所得的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進行分析，借助度中心性（DC）和介度中心性（BC）指標(biāo)進行篩選，篩選完成后根據(jù)初篩結(jié)果繼續(xù)篩選大于每個指標(biāo)所對應(yīng)的中位數(shù)的節(jié)點，得到蘭艾雙香方治療細菌感染的關(guān)鍵靶點[7-8]。

1.4 GO富集分析與KEGG富集分析 通過Metascape中對蘭艾雙香方治療細菌感染的作用靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，分別研究蘭艾雙香方治療細菌感染的主要生物功能與主要信號通路，其中P＜0.05代表富集結(jié)果顯著，并通過Metascape制作GO富集分析圖及KEGG富集分析氣泡圖[9-12]。

1.5 KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 先分別建立通路、基因相互作用關(guān)系和節(jié)點屬性、基因相互作用關(guān)系，并導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，選取主要的KEGG信號通路，構(gòu)建蘭艾雙香方治療細菌感染的“KEGG-基因”的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 主要觀察指標(biāo) ①單味藥-活性成分-作用關(guān)鍵化合物成分；②PPI網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)拓撲分析后蘭艾雙香方關(guān)鍵蛋白基因；③篩選后關(guān)鍵基因在KEGG和GO富集的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選結(jié)果 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索共收集得到蘭艾雙香方的化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）為指標(biāo)進行篩選，得到復(fù)方中共110個活性化學(xué)成分，羌活（15個）、獨活（9個）、石菖蒲（4個）、藿香（11個）、蒼術(shù)（9個）、丁香（6個）、薄荷（10個）、貫眾（7個）、苦杏仁（19個）、佩蘭（11個）和艾葉（9個）的化學(xué)成分，活性成分的基本信息見表1，相同活性成分對比見表2。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫得到蘭艾雙香方中活性成分靶點1 788個，通過驗證篩選最終確定有效靶點245個，利用Cytoscape 3.8.0軟件將蘭艾雙香方的復(fù)方活性成分及作用靶點進行分析整理得到圖1，其中菱形代表作用靶點在中間呈長方形排列，六邊形為中藥的有效成分，圓形為中藥，具體對應(yīng)見表3。

圖1 蘭艾雙香方單味藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表1 蘭艾雙香方中活性化合物基本信息

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 相同活性成分對比表

表3 蘭艾雙香方網(wǎng)絡(luò)圖物質(zhì)代表符號

2.2 蘭艾雙香方治療細菌感染潛在作用靶點預(yù)測將以細菌感染的英文“bacterial infection”為關(guān)鍵詞檢索Gene Cards，OMIM和DigSee 3個數(shù)據(jù)庫，整理篩選后獲得細菌感染的有效靶點1 442個。將靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入jvenn平臺做出韋恩圖（圖2），即蘭艾雙香方治療細菌感染的潛在作用115個靶點。

圖2 韋恩圖

2.3 蘭艾雙香方治療細菌感染的作用靶標(biāo)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及核心靶點的篩選 利用蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫STRING分析蘭艾雙香方治療細菌感染的靶點，物種選擇為“Homo sapiens”，得到蛋白相互作用關(guān)系（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖圖3A，為了更加直觀的展示，將設(shè)置自定義值置信度（“custom value confidence（0.950）”），獲得蛋白相互作用關(guān)系（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖圖3B，并隱藏在該網(wǎng)絡(luò)中與其他靶標(biāo)無互作關(guān)系的靶標(biāo)。

圖3A 蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

圖3B 蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 篩選后結(jié)果顯示，該網(wǎng)絡(luò)包含97個節(jié)點及1 428條邊，其中平均節(jié)點度值為22.31，見圖4。以節(jié)點度值為評價參數(shù)，度值越大說明其在PPI網(wǎng)絡(luò)中越重要，可能在發(fā)揮生物學(xué)功能中起著重要的作用。度值排名前10的靶點為原癌基因c-Jun（Jun）、腫瘤壞死因子（TNF）、腫瘤蛋白 p53（TP53）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、細胞核因子kp65（RELA）、白細胞介素-6（IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1（Akt1）、胱天蛋白酶 8（CASP8）、原癌基因 c-FOS（FOS），這些靶點可能是蘭艾雙香方治療細菌感染的關(guān)鍵靶點。

2.5 蛋白模塊篩選分析結(jié)果 通過Metascape數(shù)據(jù)庫分析得知，紅色區(qū)蛋白模塊代表細胞周期負調(diào)控、凋亡信號通路、細胞增殖的負調(diào)控；藍色蛋白模塊代表對金屬離子的反應(yīng)、對無機物的反應(yīng)、造血正調(diào)控；綠色蛋白模塊代表脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、脂質(zhì)定位、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)；紫色蛋白模塊代表長鏈脂肪酸生物合成過程、長鏈脂肪酸代謝過程、異源代謝過程。見圖4。

圖4 蘭艾雙香方治療細菌感染靶點蛋白互作模塊

2.6 GO富集分析及KEGG通路分析結(jié)果 通過Metascape共篩選得到 GO 條目 2401個（P＜0.05），其中生物過程（Biological processes，BP）條目 2 172個，分子功能（molecular function，MF）條目 149個，細胞組成（cell composition，CC）條目 80個，分別占 90%，6%，4%，其中生物過程主要涉及對脂多糖的反應(yīng)、對無機物質(zhì)的反應(yīng)、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、活性氧的代謝過程和對受傷的反應(yīng)等；分子功能主要涉及細胞因子受體結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚活性和磷酸酶結(jié)合等方面；細胞組成方面主要涉及膜筏、囊泡腔、細胞質(zhì)核周區(qū)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物和細胞外基質(zhì)等方面。各類別前20的條目見圖5。KEGG通路富集篩選得到324條信號通路（P＜0.05），其中排名前20的條目見圖6，根據(jù)KEGG繪制的氣泡圖見圖7。根據(jù)KEGG結(jié)果在Cytoscape 3.8.0中繪制了重要靶點通路見圖8。

圖5 蘭艾雙香方活性成分治療活性成分潛在靶點GO生物學(xué)過程、分子功能、細胞成分富集分析

圖6 蘭艾雙香方活性成分治療細菌感染潛在靶點KEGG通路富集分析

圖7 蘭艾雙香方活性成分治療細菌感染潛在靶點的KEGG通路氣泡圖

圖8 蘭艾雙香方靶點通路圖

3 討論

細菌感染是致病菌侵入血液循環(huán)系統(tǒng)后進行生長繁殖，產(chǎn)生毒素和其它代謝產(chǎn)物，所引起的全身急性感染[13]。細菌感染常合并其他疾病，當(dāng)疾病進展過程中出現(xiàn)細菌感染時，疾病的進展將向危重期發(fā)展[14-15]?？咕垢腥镜闹委煂Π┌Y、糖尿病和乙型肝炎等疾病尤為重要。扶正祛邪、調(diào)和陰陽為主的中醫(yī)理論在感染性疾病的治療中療效顯著，木其爾等[16]總結(jié)論述了中醫(yī)藥對于重癥腦病的治療實驗研究以及臨床觀察數(shù)據(jù)，得出了中醫(yī)藥治療重癥腦病療效顯著。郜賀等[17]總結(jié)了白長川教授運用中醫(yī)藥治療感染性休克的經(jīng)驗。芮慶林等[18]研究發(fā)現(xiàn)中藥對重癥肺炎發(fā)生細菌耐藥感染有明顯的干預(yù)作用，可減少耐藥發(fā)生，改善預(yù)后，減少嚴(yán)重并發(fā)癥，減少死亡率，對于減少重癥肺炎耐藥感染發(fā)生及治療預(yù)后有著積極的臨床意義。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析，蘭艾雙香方治療細菌感染的關(guān) 鍵 基 因 有 Jun、TNF、TP53、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK3、Akt1、CASP8、FOS 等。細胞因子中的 TNF、IL-6是比較重要的指標(biāo)，在細菌感染診斷中具有非常重要價值[19]。蘭艾雙香方的關(guān)鍵基因包含TNF和IL-6，進一步證實了關(guān)鍵基因發(fā)揮抗菌作用的可靠性。Jun基因的作用是識別并結(jié)合AP-1基序5'-TGA[CG]TCA-3'的轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)被HIPK3磷酸化時，促進NR5A1的活性，從而在cAMP信號通路刺激后導(dǎo)致類固醇生成基因表達增加。參與大腸癌（CRC）細胞中USP28的激活的KRAS介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活。與結(jié)直腸癌（CRC）細胞中的USP28啟動子結(jié)合。TP53是細胞內(nèi)關(guān)鍵的感應(yīng)因子，是調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的重要因素，與先天性抗病毒免疫、細胞凋亡及病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄都有關(guān)系[20]。Akt1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)代謝作用[20-21]。RELA蛋白主要在細胞質(zhì)發(fā)揮功能，在細菌之間高度保守，與大腸埃希菌RelA親緣關(guān)系最近的是福氏志賀菌，其次是柯氏檸檬酸桿菌，其在細胞生命活動中具有重要功能，RelA通過與核糖體和tRNA的相互作用介導(dǎo)細菌的嚴(yán)謹反應(yīng)，因此RelA是一種重要的翻譯因子[22]。MAPK1和MAPK3是在MAPK/ERK級聯(lián)中起重要作用的2個MAPK。它們還參與由激活的KIT和KITLG/SCF發(fā)起的信號級聯(lián)。根據(jù)細胞情況，MAPK/ERK級聯(lián)通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，翻譯，細胞骨架重排來介導(dǎo)多種生物學(xué)功能，例如細胞生長、粘附、存活和分化。MAPK/ERK級聯(lián)通過磷酸化許多轉(zhuǎn)錄因子，在分化細胞的減數(shù)分裂，有絲分裂和有絲分裂后功能的啟動和調(diào)節(jié)中也起作用。此外，MAPK/ERK級聯(lián)還參與內(nèi)體動力學(xué)的調(diào)節(jié)，包括溶酶體加工和通過核周再循環(huán)室（PNRC）的內(nèi)體循環(huán)；以及有絲分裂期間高爾基體的破碎。胱天蛋白酶激活級聯(lián)的大多數(shù)上游蛋白酶負責(zé)TNFRSF6/FAS介導(dǎo)的和TNFRSF1A誘導(dǎo)的細胞死亡。結(jié)合銜接子分子FADD會將其募集至任一受體，所得的稱為死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）的聚集體執(zhí)行CASP8蛋白水解激活。然后將活性二聚酶從DISC中釋放出來，并釋放以激活下游的凋亡蛋白酶。N末端前肽的蛋白水解片段（稱為CAP3，CAP5和CAP6）可能保留在DISC中。切割并激活CASP3，CASP4，CASP6，CASP7，CASP9 和 CASP10?？赡軈⑴c了GZMB的凋亡途徑。FOS是一種原癌基因，在正常人類細胞中可檢測到極低水平的表達，與細胞的生長、增殖活化有關(guān)[23]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中醫(yī)藥研究過程中能夠解決一些問題[24]，但也存在一定的缺陷，比如主要通過數(shù)據(jù)庫進行檢索，通過參數(shù)的設(shè)定來對成分進行篩選，但這些數(shù)據(jù)庫可能還有待完善，而參數(shù)值的確定目前也尚有爭論。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫對蘭艾雙香方的研究我們得到以下科研結(jié)果：①篩選得到蘭艾雙香方共110個藥效成分和1 788個作用靶點，關(guān)鍵靶點包括過氧化物酶體增殖物激活受體、血管內(nèi)皮生長因子A、腫瘤壞死因子和表皮生長因子受體等；②細菌感染相關(guān)靶點1 442個；③蛋白互作核心網(wǎng)絡(luò)共97個蛋白，分析得到4個蛋白模塊；④獲得2 401個GO生物過程，KEGG通路富集篩選得到324條相關(guān)信號通路，通路類型包括癌癥的路徑、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、乙型肝炎、腫瘤壞死因子信號通路、小細胞肺癌、利什曼病、HIF-1信號通路、軍團桿菌病等，這些通路均與細菌感染的發(fā)生發(fā)展相關(guān)；⑤結(jié)果證實，蘭艾雙香方可能通過調(diào)節(jié)細胞代謝、增殖與凋亡、脂代謝等多種途徑達到治療細菌感染的目的，是多成分、多靶點和多通路相互作用的結(jié)果。

蘭艾雙香方是沈舒文教授基于中醫(yī)“正氣存內(nèi)，邪不可干”理論，針對細菌感染的“濕熱”特性[24]組建的復(fù)方，方劑由羌活、獨活、石菖蒲、藿香、蒼術(shù)、丁香、薄荷、貫眾、苦杏仁、佩蘭、艾葉10味中藥組成，以芳香類藥物為主，佐以發(fā)汗解表，使外邪透表而出。藿香[25]味辛，性微溫，歸脾、胃、肺經(jīng)，芳香化濕，醒脾開胃；薄荷[26]味辛，性涼入肺、肝經(jīng)，疏散風(fēng)熱，清利頭目，利咽透疹，疏肝行氣，二藥共為君藥，行芳香化濕，解表透邪之效。羌活味辛、苦，性溫，入膀胱、腎經(jīng)，解表散寒，祛風(fēng)勝濕；獨活味辛、苦，性微溫，歸腎、膀胱經(jīng)，祛風(fēng)除濕，通痹止痛；石菖蒲味辛，性溫。歸心、胃經(jīng)，祛痰開竅，化濕開胃，寧神益智，3藥共為臣藥，助君藥化濕之功。丁香，貫眾，苦杏仁，佩蘭，艾葉共為佐藥，輔助君臣行祛濕化濁之效。

對于名老中醫(yī)沈舒文教授臨床常用經(jīng)驗方蘭艾雙香方，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究[27]，發(fā)現(xiàn)蘭艾雙香方對于癌癥、糖尿病、乙型肝炎等疾病并發(fā)細菌感染的治療具有良好的療效，尤其是以癌癥進展過程中的細菌感染。通過對蘭艾雙香方的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，進一步驗證蘭艾雙香方臨床療效的科學(xué)性，為蘭艾雙香方的臨床應(yīng)用和進一步研究提供了科學(xué)依據(jù)。