徐勇士 ，魏勃，魏甜甜，葛艷靜，孫帥楠，杭方學 *

1. 廣西大學糖業(yè)及綜合利用教育部工程研究中心（南寧 530004）；2. 廣西制糖學會（南寧 530004）；3. 廣西百桂堂食品科技有限公司（貴港 537121）；4. 廣西大學輕工與食品工程學院（南寧 530004）

甘蔗是一種多年生熱帶和亞熱帶植物，屬單子葉植物綱、禾本科、黍亞科、蜀黍族、甘蔗亞族、甘蔗屬[1]，是一種能高效地將太陽能轉化為化學能C4植物[2]。甘蔗原產于熱帶新幾內亞或印度，現(xiàn)廣泛種植在33°N和30°S之間[3]。我國是世界甘蔗種植第四大國，位于巴西、印度和泰國之后，種植面積在140萬hm2以上，年產甘蔗超過10 000萬 t[4-5]。甘蔗含有多種對人體新陳代謝有益的鐵、鈣、鉀、鈉、硒等微量元素[6-7]，以及蛋白質、氨基酸、維生素[8]、多酚類[9]、多糖類[10]、單糖[11]、黃酮類[12]、二十八烷醇[13]等營養(yǎng)物質，具有清熱、生津、下氣、潤肺等作用[14]。

發(fā)酵飲料是果蔬、谷物等發(fā)酵原料經過酵母菌、乳酸菌等微生物發(fā)酵配制而成的飲料產品[15]。微生物發(fā)酵過程中，大分子物質被降解，發(fā)生代謝合成和生物轉化等一系列反應，不但賦予了飲料新鮮獨特的風味和口感，還產生大量對人體健康有益的產物，如有機酸、酶類、維生素、氨基酸、多糖、低聚糖、酚類等[16]，近年來深受消費者青睞。

試驗以甘蔗為原料，采用酵母菌和乳酸菌二步發(fā)酵，在單因素基礎上，采用響應面優(yōu)化方法，生產甘蔗原汁乳酸發(fā)酵飲料，以期為甘蔗的多元化加工和甘蔗乳酸發(fā)酵飲料的規(guī)?；a提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗（廣西百桂堂食品科技有限公司）；果酒酵母（安琪酵母股份有限公司）；乳酸菌（實驗室保藏）；重鉻酸鉀（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；碳酸鉀（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；D-果糖標品（色譜純，上海源葉生物科技有限公司）；蔗糖標品（色譜純，上海源葉生物科技有限公司）；D-無水葡萄糖（色譜純，上海源葉生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；1114型數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱（紹興市滬越科學實驗儀器廠）；722N型可見光分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；萬用電爐（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；WAY.2S型數(shù)字阿貝折射儀（上海物理光學儀器有限公司）；DC-1015節(jié)能型智能恒溫槽（寧波新芝生物科技股份有限公司）；潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；pH計FE22（梅特勒-托利多上海有限公司）；MJ-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱（上海-恒科技有限公司）；分析天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器筒（上海東亞壓力容器制造有限公司）；AcantiJ-E多用途高效離心機（美國貝克曼庫爾有限公司）；Agilent1260 Infinity高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）。

1.3 工藝流程及部分操作要點

酵母菌活化：稱取2 g果酒酵母，加入20 mL已滅菌4%葡萄糖溶液中，輕輕晃動并于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫30 min，完成活化。

乳酸菌活化：將乳酸菌接種到液體培養(yǎng)基上37 ℃活化培養(yǎng)24 h，傳代1次；取一定量乳酸菌液到一級種子培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，作為一級種子；按5%的體積比將一級種子接種到二級種子培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，作為二級種子。

1.4 酵母菌發(fā)酵工藝試驗

選取發(fā)酵溫度、酵母菌接種量以及發(fā)酵時間3個因素，以酒精度和殘?zhí)橇繛榭疾熘笜?，在單因素試驗的基礎上，采用響應面優(yōu)化試驗方法，確定酵母菌發(fā)酵工藝參數(shù)。響應面試驗因素及水平見表1。

表1 酵母菌發(fā)酵工藝響應面試驗因素及水平

1.5 乳酸菌發(fā)酵工藝試驗

選取發(fā)酵溫度、乳酸菌接種量以及發(fā)酵時間3個因素，以發(fā)酵液的pH和乳酸含量為考察指標，在單因素試驗的基礎上，采用響應面優(yōu)化試驗方法，確定乳酸菌發(fā)酵工藝參數(shù)。響應面試驗因素及水平見表2。

表2 乳酸菌發(fā)酵工藝響應面試驗因素及水平

1.6 測定方法

酒精含量測定：參照參考文獻[17]的方法進行測定。

乳酸含量測定：采用酸堿滴定法測定。

糖含量測定：采用液相色譜法測定。色譜參數(shù)：流動相采用乙腈和超純水（V（乙腈）：V（水）= 75：25）的混合溶液，其流動相流速為1.0 mL·min-1。色譜柱，依利特Hypersil NH2柱5 mm（4.6 mm×250 mm）；柱溫，35 ℃；進樣量，10 mL；洗脫時間，15 min；采用示差檢測器，檢測溫度35 ℃。

總酚含量測定：參照參考文獻[18]的方法進行測定。

總黃酮含量測定：參照參考文獻[19]的方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 酵母菌發(fā)酵工藝試驗

2.1.1 單因素試驗

2.1.1.1 發(fā)酵溫度對酵母菌發(fā)酵的影響

由圖1可知，隨著發(fā)酵溫度的上升，總糖和蔗糖含量均呈現(xiàn)出先下降后略有上升的趨勢，酒精度的變化則呈現(xiàn)出相反的趨勢，先上升后略有下降，在發(fā)酵溫度32 ℃時，總糖和蔗糖含量最低，分別為128.56和76.92 g·L-1，酒精度最高為2.68%，這種變化趨勢表明果酒酵母是消耗糖類物質來生產酒精；在低于32 ℃時，果酒酵母的生長繁殖較慢，糖類物質利用消耗慢，產酒精少；在高于32 ℃時，酵母新陳代謝增強，老化加快，不僅影響最終產品的風味和口感，過高的發(fā)酵速率還會導致糖類物質無法被酵母充分轉化為酒精而生成其他副產物。綜合考慮，選擇30，32和34 ℃進行響應面優(yōu)化試驗。

圖1 發(fā)酵溫度對酵母菌發(fā)酵的影響

2.1.1.2 接種量對酵母菌發(fā)酵的影響

由圖2可以看出，當接種量在0.1%～0.5%之間時，接種量增加，總糖及蔗糖含量迅速下降，酒精度迅速上升；當接種量為0.5%時，酒精度達到最大值（2.75%）；當接種量超過0.5%時，隨著接種量的增加，總糖含量、蔗糖含量以及酒精度均呈現(xiàn)出下降的趨勢，這可能是由于接種量過大，酵母自身繁殖需要大量的糖類物質，用于發(fā)酵及自身代謝的量減少，導致酒精度反而降低；酵母菌的生長受到甘蔗原汁中營養(yǎng)物質的限制，其死亡速率大于生長速率，活菌數(shù)逐漸減少，無氧發(fā)酵速率降低，最終導致發(fā)酵液中酒精度降低[20]；另外接種量大，還會增大最終產品的“酵母”味，產生不愉快的口感和氣味[21]。綜合以上考慮，選擇0.5%作為酵母菌發(fā)酵的最適接種量。

圖2 接種量對酵母菌發(fā)酵的影響

2.1.1.3 發(fā)酵時間對酵母菌發(fā)酵的影響

由圖3可知，在發(fā)酵前22 h，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中的總糖含量和蔗糖含量迅速下降，酒精度的快速上升，在這段時間，酵母菌菌體大量增殖，發(fā)酵液中氧氣含量減少，酵母菌無氧發(fā)酵產乙醇的速率增加。發(fā)酵時間超過22 h后，酒精度、總糖含量和蔗糖含量變化趨于平穩(wěn)，可能是由于酵母菌進入衰退期，出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，為防止酵母長時間發(fā)酵產生不良風味，選擇發(fā)酵時間22 h。

圖3 發(fā)酵時間對酵母菌發(fā)酵的影響

2.1.2 酵母菌發(fā)酵工藝響應面優(yōu)化試驗

2.1.2.1 回歸模型與數(shù)據(jù)分析

以發(fā)酵液總糖含量為響應值進行三因素（發(fā)酵溫度X1（℃）、發(fā)酵時間X2（h）、接種量X3（%））三水平響應面分析試驗，試驗設計及結果見表3。

采用Design-Expert軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，結果見表4。三個單因素進行擬合后得到的關于Y回歸方程為Y=98.39-1.51X1-4.81X2-16.34X3+5.85X1X2+3.21X1X3+4.97X2X3+16.11X12+8.39X22+18.98X32。失擬項p=0.085 7＞0.05，不顯著，說明該模型與實際情況擬合較好。決定系數(shù)R2=0.972 1，說明試驗的3個因素能解釋響應值變化的97.21%，模型擬合程度很高，可用于分析和預測甘蔗原汁的酵母菌發(fā)酵過程；方程中X3、X12、X32對Y影響極顯著；X2、X1X2、X22對Y影響顯著，表明試驗因子與響應值是非線性關系，與二次項也有關。

表3 酵母菌發(fā)酵工藝響應面設計及響應值

表4 酵母菌發(fā)酵工藝試驗方差分析

2.1.2.2 驗證試驗

響應面試驗預測最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度31.95℃、接種量0.73%、發(fā)酵時間22.35 h，此時預測的總糖為94.64 g·L-1。為了方便操作，將工藝調整為發(fā)酵溫度32 ℃、接種量0.7%、發(fā)酵時間22.4 h。重復5組驗證試驗，實際測定的總糖為96.45 g·L-1，與預測值基本一致。

2.2 乳酸菌發(fā)酵試驗

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 發(fā)酵溫度對乳酸菌發(fā)酵的影響

溫度是影響乳酸菌生長和代謝的主要環(huán)境因素。由圖4可知，在31～37 ℃范圍內，乳酸含量與溫度呈正相關，溫度升高，乳酸含量增；超過37 ℃后，乳酸含量迅速下降，溫度較低，乳酸菌生長緩慢，產酸量較少；溫度較高，乳酸菌代謝旺盛，提早進入衰亡期，產酸量較少。pH的變化趨勢與乳酸含量相反，隨著溫度的上升而先迅速下降，當發(fā)酵溫度為37 ℃時，pH達到最低值，之后隨著發(fā)酵溫度的升高，pH緩慢升高。因此選定發(fā)酵溫度37 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對乳酸菌發(fā)酵的影響

2.2.1.2 接種量對乳酸菌發(fā)酵的影響

由圖5可知，接種量在1%～3%范圍內，隨著接種量的增加，發(fā)酵液乳酸含量增加比較快，但接種量超過3%后，乳酸含量增加緩慢，可能是因為接種量過大，發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分主要用于乳酸菌菌體的生長消耗。發(fā)酵液pH的變化與乳酸含量變化基本對應，接種量1%～3%時，pH明顯下降，超過3%后緩慢下降。所以選擇接種量3%。

圖5 接種量對乳酸菌發(fā)酵的影響

2.2.1.3 發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵的影響

由圖6可知，在發(fā)酵0～20 h時，發(fā)酵液中乳酸含量快速增加，pH迅速下降，可能是因為發(fā)酵初期營養(yǎng)成分較多，乳酸產量大；在20 h之后，乳酸含量變化很小，pH也趨于平穩(wěn)。發(fā)酵時間過短，乳酸積累不足，產品風味不好；發(fā)酵時間過長，營養(yǎng)成分大量減少，不利于乳酸菌生長代謝，開始進入衰退期。因此選定發(fā)酵時間20 h。

2.2.2 乳酸菌發(fā)酵工藝響應面優(yōu)化試驗

2.2.2.1 回歸模型與數(shù)據(jù)分析

以發(fā)酵液中乳酸含量為響應值進行三因素（乳酸菌接種量X1（%）、發(fā)酵時間X2（h）、發(fā)酵溫度X3（℃））三水平響應面分析試驗，試驗設計及結果見表5。

圖6 發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵的影響

表5 乳酸菌發(fā)酵工藝響應面設計及響應值

采用Design-Expert軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，結果見表6。乳酸含量Y對乳酸菌接種量X1、發(fā)酵時間X2、發(fā)酵溫度X3的回歸方程為Y=6.60+0.36X1+0.022X2-0.20X3-0.15X1X2-0.088X1X3+0.18X2X3-0.68X12-0.47X22-1.04X3

2。

表6 乳酸菌發(fā)酵工藝試驗方差分析

失擬項p=0.558 5＞0.05，不顯著，說明該模型與實際情況擬合較好。決定系數(shù)R2=0.989 0，說明試驗因素能解釋響應值變化的98.90%，模型擬合程度很高，可用于分析和預測甘蔗原汁乳酸發(fā)酵飲料第二階段乳酸菌發(fā)酵過程。

2.2.2.2 驗證試驗

響應面試驗預測第二階段乳酸菌發(fā)酵過程的最優(yōu)條件為發(fā)酵溫度36.67 ℃、接種量3.56%、發(fā)酵時間19.84 h，此時乳酸含量為6.66 g·L-1。結合實際條件，將條件調整為發(fā)酵溫度37 ℃、接種量3.6%、發(fā)酵時間20 h。重復5組驗證試驗，實際測定的乳酸含量平均值為6.60 g·L-1，與理論值基本一致，說明響應面優(yōu)化得到的發(fā)酵條件是可行的。

2.3 發(fā)酵前后理化性質的變化

由表7可知，pH、可溶性固形物和蔗糖含量在兩步發(fā)酵中均有降低，乳酸含量一直在增加，葡萄糖和果糖含量在酵母菌發(fā)酵階段增加，在乳酸菌發(fā)酵階段降低；可溶性固形物和蔗糖含量在酵母菌發(fā)酵階段，分別從18.1 °Bx和172.14 g·L-1降至11.2 °Bx和50.32 g·L-1，降幅很大，主要是由于酵母菌中的蔗糖酶把蔗糖分解成葡萄糖和果糖，與該階段葡萄糖和果糖含量增加對應；在乳酸菌發(fā)酵階段，蔗糖含量從50.32 g·L-1降至49.00 g·L-1，僅降低了2.62%，而葡萄糖、果糖含量則從29.02 g·L-1和30.31 g·L-1降至10.56 g·L-1和19.93 g·L-1，分別下降了63.61%和34.25%，葡萄糖和果糖的消耗量明顯高于蔗糖消耗量，說明乳酸菌更傾向于利用葡萄糖和果糖作為碳源；蔗糖、果糖和葡萄糖3種糖總量在乳酸菌發(fā)酵前后分別為109.65和79.49 g·L-1，降低了27.51%，而可溶性固形物在乳酸發(fā)酵前后分別為11.2和9.6 °Bx，僅下降了14.29%，說明乳酸菌發(fā)酵產生了其他可溶性物質，部分消除了由蔗糖、果糖和葡萄糖3種糖消耗引起的可溶性固形物的降低。

表7 甘蔗原汁發(fā)酵前后理化指標含量變化

2.4 發(fā)酵前后總酚和總黃酮的變化

由表8可知，總酚和總黃酮含量均為甘蔗原汁＜酵母菌發(fā)酵液＜發(fā)酵飲料，總酚含量依次是482.141，539.021和556.147 mg·L-1，甘蔗原汁發(fā)酵飲料總黃酮含量依次是35.102，38.405和49.036 mg·L-1；經過二步發(fā)酵，甘蔗原汁發(fā)酵飲料中總酚和總黃酮含量均明顯升高，相比于甘蔗原汁分別增加了15.35%和39.70%。

表8 甘蔗原汁發(fā)酵前后總酚和總黃酮含量

3 結論

試驗以甘蔗為原料，經壓榨提原汁，通過酵母菌發(fā)酵及乳酸菌發(fā)酵，生產甘蔗原汁發(fā)酵型乳酸飲料。在單因素試驗基礎上，進行響應面優(yōu)化，酵母菌發(fā)酵的最佳工藝條件為發(fā)酵溫32 ℃、接種量0.7%、發(fā)酵時間22.4 h；乳酸菌發(fā)酵最佳工藝條件為發(fā)酵溫度37 ℃、接種量3.6%、發(fā)酵時間20 h，得到的甘蔗飲料乳酸含量為6.60 g·L-1。經二步發(fā)酵，甘蔗原汁發(fā)酵飲料總酚和總黃酮含量均有提高，分別增加了15.35%和39.70%；乳酸發(fā)酵甘蔗原汁飲料顏色金黃，氣味芳香，口味酸甜，口感醇厚。