王巖 ，王磊 ，劉志軍，張立田 ，曹慧慧 ，李彤 *

1. 唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心（唐山 063000）；2. 河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)創(chuàng)新中心（唐山 063000）；3. 唐山市功能性農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院（唐山 063000）；4. 唐山潤澤糧油食品有限公司（唐山 063000）

白藜蘆醇是多酚類化合物，主要來源于花生、葡萄（紅葡萄酒）、虎杖、桑葚等植物。白藜蘆醇是一種生物性很強的天然多酚類物質(zhì)，又稱為芪三酚，是腫瘤的化學預防劑，也是對降低血小板聚集，預防和治療動脈粥樣硬化、心腦血管疾病的化學預防劑，被喻為繼紫杉醇之后又一新的綠色抗癌藥物。因此白藜蘆醇在醫(yī)藥、食品工業(yè)上的應用越來越廣，市場價值極高[1-6]。

花生根是花生深加工后得到的副產(chǎn)品，是白藜蘆醇的良好來源，河北省花生根年產(chǎn)量高達80多萬 t，大約占花生的30%，但70%以上的花生根作為肥料、飼料等生產(chǎn)的廉價原料，經(jīng)濟效益和社會效益很低，存在綜合利用程度低、深度開發(fā)不足和精深加工產(chǎn)品少等技術(shù)難題。而利用剩余花生根制備白藜蘆醇產(chǎn)品，有利于提高花生的資源利用率，提升花生的產(chǎn)品附加值，促進經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展。

蒸汽爆破（SE）技術(shù)，其原理主要是物料在瞬間由高溫、高壓突然降到常溫、常壓，原料內(nèi)部的水分突然汽化，氣體突然膨脹，發(fā)生噴爆，產(chǎn)生爆破效果。蒸汽爆破預處理能夠使物料組織呈海綿狀，體積增大，一些結(jié)構(gòu)組織如纖維束等被破壞，內(nèi)含物暴露，有利于目的物的溶出[7]。

試驗對蒸汽爆破提取花生根白藜蘆醇的工藝和功能特性進行深入研究，提出改性花生根白藜蘆醇作為一種功能食品配料，在我國將具有廣泛的開發(fā)應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與設備

花生根，由唐山潤澤糧油食品有限公司提供；過氧化氫、DPPH等，均為分析純，北京化學試劑公司。

JK1002電子分析天平，上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；TD5B臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；XD-3000BDQ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，江蘇太倉實驗設備廠；DR889-1電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；HH-1水浴恒溫振蕩器，江蘇國華電器有限公司；JM-65膠體磨，上海多源機械制造有限公司；蒸汽爆破設備，北京化工大學自制；S-4800掃描電子顯微鏡，日本日立公司；Dmax-MSAL 12 kW高功率粉末衍射儀，北京北達燕園微構(gòu)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蒸汽爆破（SE）處理方法

稱取200 g花生根，干燥粉碎至粒徑0.30 mm，裝入汽爆裝置內(nèi)，密封，采用電加熱，在一定時間升壓至預設壓強，并保壓一定的時間后瞬間卸壓，完成汽爆處理并收集物料。準確稱取5 g收集物于50 mL離心管中，加入25 mL 85%乙醇水溶液，水浴25 min，冷卻后于5 000 r/min離心5 min，殘渣再用25 mL 85%乙醇水溶液再次提取，充分渦旋混勻1 min，重復以上離心步驟，合并提取液，渦旋混勻。吸取2 mL上清液，過0.22 μm有機濾膜，待用。

1.2.2 響應面（response surface methodology，RSM）試驗設計

根據(jù)前期單因素試驗結(jié)果，以花生根中白藜蘆醇含量為指標進行RSM試驗設計，選取對白藜蘆醇含量影響最大的3個因素為自變量，分別以X1，X2和X3表示，并以+1，0和-1分別代表自變量的高、中和低水平，按方程xi=（Xi-X0）/ΔX對自變量進行編碼。其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，X0為實驗中心點處自變量的真實值，ΔX為自變量的變化步長。以白藜蘆醇含量Y為響應值，試驗自變量因素編碼及水平見表1。

表1 試驗自變量因素編碼及水平

假設該模型通過最小二乘法擬合的二次多項方程為

式中：Y為預測響應值；A0為常數(shù)項；A1，A2和A3為線性系數(shù)；A12，A13和A23為交互項系數(shù)；A11，A22和A33為二次項系數(shù)。

1.2.3 抗氧化能力評價

1.2.3.1 ·OH清除率的測定

參考Fenton反應體系模型，在反應體系（水楊酸-乙醇溶液9 mmol/L，F(xiàn)e2+9 mmol/L，H2O28.8 mmol/L）中加入具有清除·OH能力的物質(zhì)，與水楊酸競爭·OH，而使有色物質(zhì)生成量減少。采用固定反應時間法，在相同體積的反應體系中加入不同濃度的白藜蘆醇，并用蒸餾水作空白對照，在波長510 nm處測定加入不同濃度白藜蘆醇后的吸光度，代入式（2）計算出不同濃度的白藜蘆醇清除·OH的能力。

式中：A1為0.5 mL水楊酸-乙醇+1.0 mL白藜蘆醇+0.5 mL Fe2++5.0 mL H2O2的吸光度；A2為0.5 mL水楊酸-乙醇+1.0 mL白藜蘆醇+0.5 mL蒸餾水+5.0 mL H2O2的吸光度；A3為0.5 mL水楊酸-乙醇+1.0 mL蒸餾水+0.5 mL Fe2++5.0 mL H2O2的吸光度。

1.2.3.2 O2-·清除率的測定采用鄰苯三酚自氧化法生成O2-·。取4.0 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2），置于25 ℃水浴中預熱20 min，分別加入1 mL待測液和1 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25 ℃水浴反應5 min，加入100 μL 8% HCl溶液終止反應，在波長320 nm處測定吸光度（A）。以1 mL蒸餾水代替待測液做空白試驗。O2-· 清除率按式（3）計算。

式中：A1為4 mL Tris-HCl+1.0 mL白藜蘆醇+2 mL鄰苯三酚的吸光度；A2為4 mL Tris-HCl+1.0 mL白藜蘆醇+2 mL蒸餾水的吸光度；A3為4 mL Tris-HCl+1.0 mL蒸餾水+2 mL鄰苯三酚的吸光度。

1.2.3.3 DPPH自由基清除率的測定

將4 mL待測液加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH自由基溶液，于25 ℃水浴反應20 min，在517 nm處測定吸光度（Ai）。以蒸餾水代替待測液作空白試驗。DPPH自由基清除率按式（4）計算。

式中：A1為4 mL白藜蘆醇+2.0 mL DPPH自由基的吸光度；A2為4 mL白藜蘆醇+2.0 mL 95%乙醇的吸光度；A3為4 mL蒸餾水+2.0 mL DPPH自由基的吸光度。

1.2.4 抑菌性試驗

培養(yǎng)基的制備：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基參照文獻[8]配制。

菌懸液的制備[9]：將上述4類菌種用相應斜面培養(yǎng)基活化2次，以無菌生理鹽水配制成菌體或孢子濃度為106～108CFU/mL的菌懸液，備用。

樣品溶液的配制：采用二倍稀釋法用無菌水將SE-resveratrol稀釋成3個不同的濃度梯度，分別為0.5，1.0和2.0 g/mL。

抑菌效果測定：在無菌條件下，將0.1 mL菌懸液均勻涂布在培養(yǎng)皿中，在平板上等距離放入無菌牛津杯，在杯內(nèi)注入200 μL上述SE-resveratrol溶解液。培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察抑菌圈大小，量取各抑菌圈直徑。試驗組均做3次平行試驗，取其平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用Design-Expert 7.0進行試驗設計和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應面試驗分析

2.1.1 Box-Behnken試驗設計方案及試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，選取蒸汽溫度（X1）、保壓時間（X2）、壓力（X3）為自變量，以白藜蘆醇含量為響應值Y，試驗方案及結(jié)果見表2。試驗方案的15個試驗點中包括12個析因點（1～12）和3個中心點（13～15），中心點重復的目的是估計整個試驗的純試驗誤差。

2.1.2 模型方程的建立及顯著性分析

利用Design-Expert 7.0軟件對表2中試驗數(shù)據(jù)進行二次線性回歸擬合，得到數(shù)學模型：

表2 Box-Behnken 試驗方案及結(jié)果

該模型系數(shù)顯著性檢驗見表3，模型方差分析結(jié)果見表4。從表4可看出，模型極顯著（p＜0.001），因變量與所考察自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.994 8，模型調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.992 3，說明該模型能解釋99.23%響應值的變化，該模型擬合程度良好，失擬項不顯著（p＞0.05），說明試驗所得二次回歸方程能很好地對響應值進行預測。從表3回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，白藜蘆醇含量模型中一次項X2、X3表現(xiàn)為極顯著；二次項X12、X22、X32極顯著；交互項X1X3、X2X3極顯著。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗

表4 回歸模型方差分析

2.1.3 響應面分析

根據(jù)回歸方程作響應面圖，考察所擬合的響應面的形狀，分析蒸汽溫度、保壓時間和壓力對白藜蘆醇含量的影響，所得響應面見圖1～圖3?？梢钥闯?，在因素所考察的范圍內(nèi)白藜蘆醇含量隨著蒸汽溫度、保壓時間和壓力的變化均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。這可能的原因是花生根在適當?shù)恼羝麥囟?、保壓時間和壓力下，結(jié)構(gòu)疏松，呈蜂窩狀，利于溶劑提取，提高了白藜蘆醇的含量，但過高的溫度或壓力會導致白藜蘆醇的降解，從而含量降低。

2.1.4 SE工藝條件的優(yōu)化和可靠性驗證

為進一步確定SE工藝的最佳點，用Design-Expert 7.0軟件進行驗證優(yōu)化，得白藜蘆醇最佳提取工藝：蒸汽溫度180.6 ℃、保壓時間4.95 min、壓力1.04 MPa，在此條件下花生根中白藜蘆醇的理論提取率為139.6mg/kg?？紤]到可操作性，將最優(yōu)條件定為蒸汽溫度180 ℃、保壓時間5 min、壓力1.0 MPa。用此最優(yōu)提取條件進行驗證，白藜蘆醇的含量為139.2 mg/kg，與理論值較為接近，表明數(shù)學模型對優(yōu)化花生根中白藜蘆醇的SE提取工藝是可行的。

圖1 蒸汽溫度和壓力對白藜蘆醇含量交互影響

圖2 蒸汽溫度和保壓時間對白藜蘆醇含量交互影響

圖3 壓力和保壓時間對白藜蘆醇含量的交互影響

2.2 白藜蘆醇抗氧化能力分析

現(xiàn)代醫(yī)學證明，脂質(zhì)氧化所產(chǎn)生的自由基在癌癥腫瘤形成的起始和促成階段都起重要作用。機體在代謝過程中產(chǎn)生的自由基有超氧陰離子自由基、羥自由基、氫過氧自由基。其中，羥自由基是最危險的自由基，而白藜蘆醇中的多酚類物質(zhì)具有清除超氧陰離子自由基和羥自由基的能力已被證實，在治療心血管病和老年性癡呆癥方面獨具療效[10]。

如圖4可知，在質(zhì)量濃度1.0～6.0 mg/mL范圍內(nèi)，·OH清除率與白藜蘆醇質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。controlresveratrol和SE-resveratrol線性方程分別為y=9.456x+7.266（R2=0.999 3）和y=11.016x+8.691（R2=0.999 6）。根據(jù)線性方程，IC50分別為4.23和3.77 mg/mL。

圖4 control-resveratrol和SE-resveratrol對·OH清除能力

如圖5可知，在質(zhì)量濃度1.0～6.0 mg/mL范圍內(nèi)，O2-·清除率與白藜蘆醇質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。controlresveratrol和SE-resveratrol線性方程分別為y=9.859+8.152（R2=0.999 1）和y=10.869x+9.021（R2=0.999 7）。根據(jù)線性方程，IC50分別為4.52和3.75 mg/mL。

圖5 control-resveratrol和SE-resveratrol對O2-·清除能力

如圖6可知，在質(zhì)量濃度1.0～6.0 mg/mL范圍內(nèi)，DPPH清除率與白藜蘆醇質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。controlresveratrol和SE-resveratrol線性方程分別為y=5.543x+10.254（R2=0.999 4）和y=13.869x+10.624（R2=0.999 8）。根據(jù)線性方程，IC50分別為7.17和2.83 mg/mL。

圖6 control-resveratrol和SE-resveratrol對DPPH清除能力

2.3 SE-resveratrol抑菌能力

由表5可知，花生根中白藜蘆醇對食品中常見的污染菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和四聯(lián)桿菌）的抑制作用明顯，且隨SE-resveratrol濃度的增加，抑菌圈直徑逐漸增大，表明抑菌效果隨著SE-resveratrol濃度的增加而增強。在4種供試菌種中，花生根中白藜蘆醇對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，其次為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、四聯(lián)球菌。蔡楊柳等[11]研究了虎杖白藜蘆醇的抑菌效果，結(jié)果表明質(zhì)量濃度0.125 mg/mL白藜蘆醇對金黃色葡萄球菌的抑菌率為80%，而質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的白藜蘆醇對大腸桿菌的抑菌率為40%。

表5 不同濃度SE-resveratrol溶解液的抑菌作用

3 結(jié)論

1) 應用響應面分析法建立了SE提取花生根中白藜蘆醇的工藝模型，模型調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.992 3，說明該模型能解釋99.23%響應值的變化，該模型擬合程度良好，失擬項不顯著（p＞0.05），說明試驗所得二次回歸方程能很好預測白藜蘆醇含量隨各參數(shù)變化的規(guī)律。

2) 通過Design-Expert 7.0軟件，采用Box-Behnken試驗設計法對SE提取花生根中白藜蘆醇工藝進行設計并優(yōu)化。結(jié)果表明，保壓時間和保壓壓力對白藜蘆醇含量的影響均極顯著（p＜0.01）；蒸汽溫度和壓力、保壓時間和壓力的交互作用極顯著（p＜0.01）。

3) SE提取花生根中白藜蘆醇的最佳工藝條件為蒸汽溫度180 ℃，保壓時間5 min，壓力1.0 MPa。在此條件下白藜蘆醇含量為139.2 mg/kg。經(jīng)檢驗，該提取白藜蘆醇工藝參數(shù)是合理可靠的。

4) 蒸汽爆破處理后，花生根中白藜蘆醇對DPPH、O2-·和·OH清除率明顯高于未處理樣品，其對自由基清除能力有所增強。

5) SE-resveratrol溶解液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和四聯(lián)球菌抑制作用明顯，并隨濃度的增加，抑制能力增強，其對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出更高的抑菌效果。