陳曦 ，邢敏 ，李興國(guó) ，焦超芹，郭鸰，費(fèi)鵬 *

1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（洛陽 471023）；2. 河南科技大學(xué)河南省食品綠色加工與質(zhì)量安全控制國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室（洛陽 471023）；3. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（哈爾濱 150030）

奶酒，又稱為乳酒，其主要以牛奶、馬奶等為原料，在發(fā)酵劑的作用下經(jīng)發(fā)酵加工而成，根據(jù)制作工藝不同可將其分為發(fā)酵性奶酒和蒸餾型奶酒[1]。奶酒呈乳白色，具有舒適的奶香及酒香味，酒精度較低，是蒙古族具有民族特色的一種傳統(tǒng)飲料酒[2]。研究表明，奶酒含有豐富的氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以及多種有益微生物，具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]。適量食用奶酒還可促進(jìn)機(jī)體新陳代謝，增強(qiáng)免疫力，對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、高血脂等慢性疾病具有極好輔助治療作用[4]。

牡丹屬芍藥科芍藥屬多年生落葉灌木，是一種藥食兩用植物，其花大，單生，顏色鮮艷，主要呈深紅色、粉紅色和白色[5]。牡丹花富含多酚類、黃酮類、沒食子酸等活性成分，具有清熱解毒、抗腫瘤、抗菌、降血壓等功效，經(jīng)常食用還能起到活血化瘀、美容養(yǎng)顏的作用，因而深受女性人群的青睞[6-8]。同時(shí)，其含有的原花色素物質(zhì)具有較好的抗氧化活性，抗氧化能力分別為維生素E、維生素C的10倍、20倍[9]。此外，牡丹花還含有萜烯類、醇類、酯類等天然香味物質(zhì)[10]。由此可見，其在改善食品風(fēng)味及功能性食品的開發(fā)方面具有利用價(jià)值。劉鳳梅[11]研制出的牡丹花葡萄酒風(fēng)味獨(dú)特，且具有一定保健功效。趙貴紅[12]通過正交試驗(yàn)研究牡丹花粉山藥酸奶的最佳配方。除此之外，營(yíng)養(yǎng)型牡丹梨酒、牡丹花櫻桃果酒等產(chǎn)品也已經(jīng)被開發(fā)出來[13-14]。然而關(guān)于牡丹花奶酒的研究尚未見報(bào)道。

鑒于此，試驗(yàn)以牡丹花、鮮牛乳為主要原料，以感官評(píng)價(jià)指標(biāo)為依據(jù)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)探討白砂糖、酒曲、牡丹花及脫脂乳粉添加量在牡丹花奶酒中最適比例，確定最佳產(chǎn)品配方。通過測(cè)定其對(duì)3種不同抗氧化體系的清除效果評(píng)估其抗氧化活性，以期為牡丹花綜合利用及功能性新型奶酒的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡丹花、白砂糖、酒曲、安家脫脂乳粉（洛陽大張超市）。

硫酸亞鐵（天津凱通化學(xué)試劑有限公司）；鄰苯三酚、無水乙醇（天津市德恩化學(xué)試劑有限公司）；過氧化氫、DPPH（洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（天津市大陸化學(xué)試劑廠）；VC、鄰二氮菲（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；D-異抗壞血酸鈉（諸城華源生物工程有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

P1203型精密電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DPH-9272型恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；Bcn-1360型生物超凈工作臺(tái)（上海佳勝儀器制造有限公司）；冰箱（青島海爾股份有限公司）；電磁爐（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.3 牡丹花奶酒的制備流程

牡丹花的篩選、清洗→研磨→混合→殺菌（94℃，1 min）→發(fā)酵（添加酒曲室溫發(fā)酵50 h）→過濾→殺菌（94 ℃，1 min）→檢測(cè)→成品

1.4 單因素試驗(yàn)

以感官評(píng)分為指標(biāo)，采用控制變量法考察白砂糖添加量（8%，10%，12%，14%和16%），酒曲添加量（0.25%，0.50%，0.75%，1.00%和1.25%）、牡丹花添加量（5%，10%，15%，20%和25%）及脫脂乳粉添加量（7.5%，10.0%，12.5%，15.0%和17.5%）對(duì)牡丹花奶酒感官品質(zhì)的影響，確定最佳添加量。

1.5 正交試驗(yàn)

為獲得較為理想的產(chǎn)品，以單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，選取白砂糖添加量、酒曲添加量、牡丹花添加量以及脫脂乳粉添加量4個(gè)因素，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)牡丹花奶酒的配方進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平 單位：%

1.6 感官評(píng)定

邀請(qǐng)6人（3男3女）組成評(píng)定小組，采用“先漱口、后品嘗”方式對(duì)所制成的牡丹花奶酒從色澤、香味、氣味、風(fēng)格4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分（總共100分），感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 牡丹花奶酒感官評(píng)價(jià)表

1.7 抗氧化活性分析

準(zhǔn)確稱量10 mL牡丹花奶酒與未添加牡丹花的普通奶酒，按照料液比1︰9 g/mL將產(chǎn)品溶解于無水乙醇中進(jìn)行稀釋，混合均勻后4 000 r/min條件下離心10 min，取上清液備用。

1.7.1 牡丹花奶酒對(duì)·OH的測(cè)定

·OH是活潑性最強(qiáng)、毒性最大的自由基，能夠直接對(duì)生物大分子、細(xì)胞膜等造成嚴(yán)重?fù)p傷[15]。參考吳國(guó)宏等[16]的方法，采用H2O2/Fe體系反應(yīng)法進(jìn)行測(cè)定。依次向試管中加入2 mL、2 mL、6 mL濃度6 mmol/L的FeSO4溶液、H2O2溶液、水楊酸，37 ℃水浴15 min，分別加入0.5 mL的牡丹花奶酒上清液，37 ℃條件下水浴30 min，于510 nm處測(cè)定其吸光度，記為A1，使用蒸餾水分別代替水楊酸、樣品溶液，再次測(cè)定其吸光度，記為A2、A0。相同方法處理后的普通奶酒作為對(duì)照組，·OH清除率計(jì)算如式（1）所示。

1.7.2 牡丹花奶酒對(duì)O2-清除率的測(cè)定

O2-與機(jī)體的氧化損傷有著密切的聯(lián)系，是評(píng)價(jià)抗氧化活性的一項(xiàng)重要指標(biāo)[17]。采用鄰苯三酚自氧化法進(jìn)行測(cè)定，參考盛亞男等[18]的方法并做修改。取Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）和3 mmol/L鄰苯三酚溶液于25 ℃條件下預(yù)熱20 min，在試管中分別加入1 mL牡丹花奶酒上清液及預(yù)熱后的Tris-HCl緩沖液4.5 mL、鄰苯三酚溶液0.3 mL，振蕩均勻，25 ℃水浴5 min后加入1 mL 8 mol/L HCl溶液以終止反應(yīng)，于330 nm處測(cè)定吸光度A1，使用蒸餾水代替鄰苯三酚再次測(cè)定，其吸光度記為A0。相同方法處理后的普通奶酒作為對(duì)照組，O2-清除率的計(jì)算如式（2）所示。

1.7.3 牡丹花奶酒對(duì)DPPH清除率的測(cè)定

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，產(chǎn)品對(duì)其清除率的大小是評(píng)價(jià)抗氧化活性的另一項(xiàng)重要指標(biāo)[19]。參考任曼妮等[20]的方法，采用DPPH比色法測(cè)定并稍作修改。用無水乙醇溶解DPPH使其濃度0.2mmol/L，向樣品管中按順序加入牡丹花奶酒上清液和醇溶DPPH各2 mL；在對(duì)照管中依次加入2 mL的牡丹花奶酒上清液和無水乙醇；向空白管按順序添加2 mL醇溶DPPH和無水乙醇。混合均勻并置于黑暗處?kù)o置30 min，于517 nm處檢測(cè)其吸光度，依次記為A1，A2，A0。相同方法處理后的普通奶酒作為對(duì)照組，按照式（3）計(jì)算DPPH自由基的清除率。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 白砂糖添加量對(duì)牡丹花奶酒感官評(píng)定的影響

選取白砂糖添加量為8%，10%，12%，14%和16%，分析白砂糖添加量對(duì)牡丹花奶酒感官評(píng)定的影響。結(jié)果如圖1所示，白砂糖添加量12%為最佳。

圖1 白砂糖添加量對(duì)牡丹花奶酒感官評(píng)定的影響

2.1.2 酒曲添加量對(duì)牡丹花奶酒感官評(píng)定的影響

選取酒曲添加量0.25%，0.50%，0.75%，1.00%和1.25%，分析酒曲添加量對(duì)牡丹花奶酒感官評(píng)定的影響。結(jié)果如圖2所示，酒曲添加量0.50%為最佳。

2.1.3 牡丹花添加量對(duì)牡丹花奶酒感官評(píng)定的影響

選取牡丹花添加量5%，10%，15%，20%和25%，分析牡丹花添加量對(duì)牡丹花奶酒感官評(píng)定的影響，結(jié)果如圖3所示。

牡丹花添加量15%的奶酒感官評(píng)分最高，之后隨著牡丹花添加量增加，感官評(píng)分逐漸趨于平緩，這主要是由于牡丹花的香味沒有酒味那么強(qiáng)烈，對(duì)整體風(fēng)味變化不明顯所致。因此，牡丹花添加量15%為最佳。

圖2 酒曲添加量對(duì)牡丹花奶酒感官評(píng)定的影響

圖3 牡丹花添加量對(duì)牡丹花奶酒的感官評(píng)定的影響

2.1.4 脫脂乳粉添加量對(duì)牡丹花奶酒感官評(píng)定的影響

選取脫脂乳粉添加量7.5%，10.0%，12.5%，15.0%和17.5%，分析脫脂乳粉添加量對(duì)牡丹花奶酒感官評(píng)定的影響。結(jié)果如圖4所示，脫脂乳粉添加量10.0%為最佳。

圖4 脫脂乳粉添加量對(duì)牡丹花奶酒的感官評(píng)定影響

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用正交試驗(yàn)對(duì)牡丹花奶酒的配方進(jìn)行優(yōu)化，其試驗(yàn)結(jié)果見表3所示。

由表3可以看出，4個(gè)因素對(duì)牡丹花奶酒感官評(píng)分影響的強(qiáng)弱順序依次為牡丹花添加量＞脫脂乳粉添加量＞酒曲添加量＞白砂糖添加量，且產(chǎn)品的最佳組合為A2B2C2D2，即白砂糖添加量12%、酒曲添加量0.5%、牡丹花添加量15%、脫脂乳粉添加量10%。在此最優(yōu)組合下，牡丹花奶酒的3次水平驗(yàn)證試驗(yàn)的感官評(píng)分分別為90.00，93.00和93.00分，均高于正交試驗(yàn)表中得分。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果表

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 牡丹花奶酒對(duì)·OH的清除作用

牡丹花奶酒與普通奶酒對(duì)·OH清除率的測(cè)定結(jié)果如圖5所示。與普通奶酒相比，牡丹花奶酒對(duì)·OH清除能力顯著增加（p＜0.05），其清除率為32.61%。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牡丹花瓣提取物能夠顯著清除·OH并抑制DNA損傷，且濃度越大，抑制作用越強(qiáng)[21]。因此，結(jié)果表明，牡丹花的添加可以增強(qiáng)產(chǎn)品清除·OH的能力。

圖5 牡丹花奶酒對(duì)·OH的清除率

2.3.2 牡丹花奶酒對(duì)O2-的清除作用

由圖6可知，牡丹花奶酒對(duì)O2-清除率為20.16%，顯中著含高有于的普多通酚奶、酒類（黃p酮＜、0.0原5）花。色這素可等能活是性由物于質(zhì)牡對(duì)丹O花2-具有較好清除能力所致，其中牡丹黃酮類化合物對(duì)O2-清除能力可達(dá)85.1%～92.8%，且高于對(duì)·OH清除能力[22]。因此，牡丹花的加入能夠明顯提高普通奶酒對(duì)O2-清除能力。

2.3.3 牡丹花奶酒對(duì)DPPH自由基清除作用

以普通奶酒為對(duì)照，評(píng)估牡丹花奶酒對(duì)DPPH的清除效果，結(jié)果見圖7。牡丹花奶酒對(duì)DPPH的清除率為22.45%，顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），且為對(duì)照組的17倍。由此可知，牡丹花奶酒具有更強(qiáng)的清除DPPH能力。

圖6 牡丹花奶酒對(duì)O2-清除率

3 結(jié)論

探討牡丹花奶酒的最佳配方及其抗氧化活性。結(jié)果表明，牡丹花奶酒的最佳配方為白砂糖添加量12%、酒曲添加量0.5%、牡丹花添加量15%、脫脂乳粉添加量10%。此外，抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示牡丹花的加入使得產(chǎn)品對(duì)·OH、O2-、DPPH自由基的清除能力有顯著增強(qiáng)作用。牡丹花奶酒不僅實(shí)現(xiàn)牡丹花的多方向利用，豐富產(chǎn)品種類，還具有一定抗氧化活性，因此具有良好發(fā)展前景。