常影，焦巖, *，佟佳路，崔璐麟，韓赫，鄭博瀚

1. 齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（齊齊哈爾 161006）；2. 黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（齊齊哈爾 161006）

葉黃素是人體所需的一種重要的類胡蘿卜素，來(lái)源于多種植物的果實(shí)、根莖和花等，具有多種生理功能和保健作用。葉黃素對(duì)單線態(tài)氧和自由基具有較強(qiáng)的清除作用，能夠減少自由基對(duì)機(jī)體的損傷和增強(qiáng)免疫力[1-2]；葉黃素可以過(guò)濾對(duì)人體有害的藍(lán)光，減少其對(duì)人體皮膚和視網(wǎng)膜等輻射損傷[3]；葉黃素和玉米黃素在人體視網(wǎng)膜中發(fā)揮重要作用，可保護(hù)視網(wǎng)膜中的黃斑區(qū)防止損傷[4]；葉黃素還具有抗炎和抗免疫反應(yīng)作用，可防止動(dòng)脈硬化等疾病的發(fā)生，還具有預(yù)防和抑制多種癌癥等功效[5-7]。但是，葉黃素分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)不飽和雙鍵等活性基團(tuán)，不僅溶解性差，而且在光、熱和酸堿等條件下極易發(fā)生分解和喪失活性，在體內(nèi)吸收利用率也較低。因此，目前多采用分子包埋等方法來(lái)提高葉黃素的穩(wěn)定性和體內(nèi)外傳遞性能[8]。

玉米蛋白是一種醇溶性蛋白，來(lái)自于玉米淀粉加工的副產(chǎn)物玉米黃粉中，具有安全無(wú)毒、可生物降解等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于食品和飼料等行業(yè)[9]。玉米蛋白分子含有較多的疏水性氨基酸，具有兩親性質(zhì)和自組裝性能，對(duì)脂溶性成分具有包埋和載運(yùn)和緩控釋作用，作為葉黃素等生物活性物質(zhì)載體具有生物相容性、可降解性、自組裝性及抗分解等優(yōu)點(diǎn)，可提高有效提活性成分的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)活性成分作用時(shí)間，因此近年來(lái)多用于活性油脂、香精香料等成分的負(fù)載與包埋，以提高其穩(wěn)定性和生物活性[10-11]。

但是，玉米醇溶蛋白含有較多的疏水性氨基酸，溶解性和吸收性較差，難以將負(fù)載芯材輸送到有效部位而增強(qiáng)吸收和利用率。

因此，研究采用酶法修飾玉米醇溶蛋白可改變其微觀結(jié)構(gòu)和功能特性，限制性酶解得到的玉米蛋白肽作為功能載體可顯著提高對(duì)葉黃素的包封率、溶解分散性和穩(wěn)定性，進(jìn)而增強(qiáng)葉黃素的活性和生理功能。本研究為玉米蛋白作為葉黃素類生物活性有效載體及其功能性研究與開發(fā)提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高純度玉米醇溶蛋白，胃蛋白酶，美國(guó)Sigma公司。葉黃素，純度≥95%，上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、石油醚和其他化學(xué)試劑等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Nano-Zs90粒徑分析儀，德國(guó)新帕泰克有限公司；F30型透射電子顯微鏡，美國(guó)FEI公司；RE2000E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，西安太康生物科技有限公司；CJJ-931型磁力加熱攪拌器，常州萬(wàn)達(dá)升實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TDL-5-A型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-2450型紫外分光光度計(jì)，日本島津；PC/PLC LD-53型冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Millrock公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米蛋白酶法修飾

采用胃蛋白酶對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行酶解修飾：取0.5 g玉米醇溶蛋白加入到25.0 mL純水中混勻，加入一定量的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH，在40～65 ℃條件下酶解1～6 h。酶反應(yīng)后在95 ℃條件下蒸煮5 min滅酶。玉米蛋白酶解物凍干后儲(chǔ)存在4 ℃條件下備用[12]。

1.3.2 玉米醇溶蛋白（Zein）及其酶修飾產(chǎn)物（ZH）負(fù)載葉黃素納米粒的制備

根據(jù)前期研究方法采用反溶劑法制備ZL和ZHL納米粒，并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)：取一定量的玉米醇溶蛋白（Zein）或其酶修飾產(chǎn)物（ZH）溶解到85%的乙醇溶液中配制成質(zhì)量濃度0.5 mg/mL溶液，加入等體積85%葉黃素乙醇溶液，在1 000 r/min下室溫磁力攪拌30min，然后在3 000 r/min下離心5 min，取上清液注入到等體積磷酸鹽緩沖液中混勻后，經(jīng)真空濃縮法除去乙醇，得到ZL和ZHL納米粒溶液[13]。

1.3.3 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及含量的測(cè)定

取上述配制不同質(zhì)量濃度的葉黃素85%乙醇溶液，在最大吸收波長(zhǎng)445 nm處測(cè)定吸光度，制作葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。得到葉黃素質(zhì)量濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)方程y=0.176 3x+0.004 4（R2=0.999 1），因此，0.5～3.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)葉黃素標(biāo)準(zhǔn)液在波長(zhǎng)445 nm處線性關(guān)系良好[13]。

1.3.4 包封率的測(cè)定

取3.0 mL ZL和ZHL納米粒溶液，加入3 mL石油醚振蕩混勻1.0 min，在3 000 r/min離心轉(zhuǎn)速下離心5.0min，重復(fù)試驗(yàn)操作3次，合并上清液，在445 nm處測(cè)吸光度并計(jì)算葉黃素含量，根據(jù)以式（1）計(jì)算包封率[14]。

圖1 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線

式中：EE為包封率，%；C為葉黃素溶液質(zhì)量濃度，μg/mL；M為葉黃素總質(zhì)量，μg；V為溶液的總體積，mL。

1.3.5 酶解修飾玉米醇溶蛋白對(duì)葉黃素包封率影響單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 酶解時(shí)間對(duì)玉米蛋白負(fù)載葉黃素包封率的影響

將0.5 g玉米醇溶蛋白加入到25.0 mL純水中混勻，在胃蛋白酶用量為1.5%，溫度為50 ℃條件下酶解1～6h，酶反應(yīng)后在95 ℃條件下蒸煮5 min滅酶。按照上述方法制備ZL和ZHL納米粒并測(cè)定包封率，研究酶解時(shí)間對(duì)玉米蛋白負(fù)載葉黃素包封率的影響。

1.3.5.2 酶用量對(duì)玉米蛋白負(fù)載葉黃素包封率的影響

在胃蛋白酶用量分別為5，10，15，20，25和30 mg/g蛋白，pH 3.0，溫度為50 ℃條件下酶解4 h，酶反應(yīng)后在95 ℃條件下蒸煮5 min滅酶。按照上述條件制備ZL和ZHL納米粒并測(cè)定包封率，研究酶用量對(duì)玉米蛋白負(fù)載葉黃素包封率的影響。

1.3.5.3 酶解溫度對(duì)玉米蛋白負(fù)載葉黃素包封率的影響

在胃蛋白用量分別為1.5%，pH 3.0，溫度為40，45，50，55，60和65 ℃條件下酶解4 h，酶反應(yīng)后在95 ℃條件下蒸煮5 min滅酶。按照上述方法制備ZL和ZHL納米粒并測(cè)定包封率，研究酶解溫度對(duì)玉米蛋白負(fù)載葉黃素包封率的影響。

1.3.6 酶解修飾玉米蛋白制備葉黃素納米粒正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取酶解時(shí)間、酶用量、酶解溫度和pH 4個(gè)主要的影響因素，以葉黃素包封率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別采用酶解玉米蛋白進(jìn)行負(fù)載葉黃素納米粒制備試驗(yàn)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.7 粒徑分析測(cè)定

將上述方法制備的ZL和ZHL納米粒溶液用0.45 μm濾膜過(guò)濾，取1.0 mL樣品置于Nano-Zs90粒徑分析儀樣品池中進(jìn)行分析，得到二者的粒徑大小分布圖譜[15]。

1.3.8 透射電子顯微鏡（TEM）觀察

將ZL和ZHL納米粒樣品放入具有碳膜的400目的銅格柵上，然后采用紅外燈將載有納米顆粒的銅格柵烘干，15 min后進(jìn)行觀測(cè)ZL和ZHL納米粒的微觀結(jié)構(gòu)[16]。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 10.0和Excel軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZHL納米粒制備單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 玉米蛋白酶解時(shí)間對(duì)葉黃素包封率的影響

由圖2以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，由于大分子的玉米蛋白不斷的被蛋白酶水解為小分子蛋白和肽類，和葉黃素的結(jié)合效率提高，因此，玉米蛋白酶解物對(duì)葉黃素的包封率逐漸升高，4 h達(dá)到最大。當(dāng)酶解時(shí)間繼續(xù)增加，葉黃素包封率降低，可能是由于產(chǎn)生較多的小分子肽類不利于葉黃素的包埋而使得包埋率有所降低，因此，酶解4 h所制備的玉米蛋白酶解物負(fù)載葉黃素效果最佳。

圖2 玉米蛋白酶解時(shí)間對(duì)葉黃素包封率的影響

2.1.2 酶用量對(duì)葉黃素包封率的影響

由圖3以看出，在酶用量較低的情況下，由于蛋白酶的濃度低，酶解效率低，從而使得葉黃素包封效果較差；當(dāng)酶用量達(dá)到15 mg/g時(shí)，酶對(duì)底物蛋白適當(dāng)水解，酶解產(chǎn)物能夠與葉黃素結(jié)合充分，包封率最高；但當(dāng)酶用量超過(guò)15 mg/g時(shí)，由于酶解過(guò)度，產(chǎn)生大量的小分子物質(zhì)，包封率又出現(xiàn)下降趨勢(shì)，因此，該酶用量條件下所制備葉黃素納米粒效果最好。

圖3 酶用量對(duì)葉黃素包封率的影響

2.1.3 玉米蛋白酶解溫度對(duì)葉黃素包封率的影響

由圖4可知，溫度對(duì)玉米蛋白的酶解效果和葉黃素的包封率有重要影響，隨著溫度的增加，包封率增大，在40～55 ℃之間，增加的趨勢(shì)較為明顯，當(dāng)溫度超過(guò)55 ℃，包封率變化呈下降趨勢(shì)。因?yàn)闇囟壬哂兄诿富钚栽鰪?qiáng)，進(jìn)而酶解蛋白產(chǎn)生較多的小分子蛋白提高對(duì)葉黃素的包封率，但是由于溫度過(guò)高會(huì)使蛋白變性，使酶逐漸失去活性，使酶解效率降低，因此，55 ℃時(shí)為最適酶解溫度。

圖4 玉米蛋白酶解溫度對(duì)葉黃素包封率的影響

2.1.4 玉米蛋白酶解pH對(duì)葉黃素包封率的影響

由圖5可知，胃蛋白酶受pH的影響較大，酶活性在酸性pH 1.0～2.0條件下酶活較高。但是，pH較低時(shí)葉黃素不穩(wěn)定，且影響水解物對(duì)其包封效果，當(dāng)酶解的pH達(dá)到3.0時(shí)酶解物對(duì)葉黃素的包封效果最佳，可達(dá)到94.8%，此pH條件下蛋白被適度水解，有利于與葉黃素結(jié)合使得包封效果較好。隨著pH的升高，酶的活性逐漸減小，酶解效果降低使得對(duì)葉黃素的包封率降低。

圖5 玉米蛋白酶解pH對(duì)葉黃素包封率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

按上述方法分別進(jìn)行正交試驗(yàn)測(cè)定葉黃素的包封率，結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

從表2可知，玉米蛋白酶解對(duì)葉黃素包封率影響因素大小順序?yàn)镃（酶解溫度）＞D（pH）＞A（酶解時(shí)間）＞B（酶解用量），最佳組合為A1B1C2D1，在此最佳組合條件下進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，得到優(yōu)化后葉黃素的包封率為95.86%±0.95%（n=3），小于A1B2C2D2條件下包封率，即酶解時(shí)間3 h、酶解用量15 mg/g、酶解溫度55 ℃、酶解pH為3.0，此時(shí)葉黃素最大包封率，為96.03%±1.38%。

2.3 玉米蛋白酶解修飾前后對(duì)葉黃素包封效率的比較分析

按照1.3.2方法分別制備ZL和ZHL納米粒，對(duì)葉黃素的包封率進(jìn)行分析測(cè)定，并對(duì)酶解修飾前后玉米蛋白負(fù)載葉黃素納米粒包封率進(jìn)行比較分析，如圖6所示，玉米蛋白對(duì)葉黃素的包封率為80.79%±1.05%，而經(jīng)過(guò)酶解修飾后的玉米蛋白對(duì)葉黃素的包封率在上述條件下最大可達(dá)96.03%±1.38%，包封率提高了15.24個(gè)百分點(diǎn)，說(shuō)明經(jīng)胃蛋白酶修飾的玉米蛋白可有效提高對(duì)葉黃素的負(fù)載能力。

2.4 ZL和ZHL納米粒粒徑分析

采用Nano-Zs90粒徑分析儀對(duì)玉米蛋白負(fù)載葉黃素納米粒（ZL）和酶解玉米蛋白負(fù)載葉黃素納米粒（ZHL）的粒徑分析，如圖7可知，所制備的ZL和ZHL納米粒的粒徑分布范圍較窄，大小均在100 nm范圍，且粒子徑分布區(qū)域較為均勻，說(shuō)明玉米蛋白和酶解后的玉米蛋白均能通過(guò)上述反溶劑法對(duì)葉黃素進(jìn)行負(fù)載包埋形成微觀納米粒子結(jié)構(gòu)，粒子在溶液中分布較為均一穩(wěn)定。在相同條件下，ZL納米粒的平均粒徑為（158.40±3.22）nm，而該酶解玉米蛋白條件下ZHL納米粒的粒徑為由于酶解作用平均粒徑減小為（112.24±1.56）nm，可能是由于酶解作用產(chǎn)生了小分子蛋白和多肽，與葉黃素結(jié)合較好，導(dǎo)致所制備的納米粒的粒徑有所減小，并提高了葉黃素的包封效果。

圖6 酶解修飾前后玉米蛋白對(duì)葉黃素包封率比較

圖7 ZL和ZHL納米粒的粒徑分布

2.5 透射電子顯微鏡（TEM）結(jié)果與分析

采用H-7650透射電子顯微鏡對(duì)ZL和ZHL納米粒的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和比較，如圖8和圖9所示，玉米蛋白及其酶解物均能夠與葉黃素結(jié)合形成納米粒子復(fù)合體結(jié)構(gòu)。Zein與葉黃素形成的納米粒ZL大致呈球形顆粒狀態(tài)，粒徑分布范圍在200 nm范圍以內(nèi)，但是納米粒子聚集較多，分布不是很均勻，結(jié)果導(dǎo)致粒徑變大。而ZHL納米粒的粒子徑分布較小，且粒子比較均勻，分散性較好，與Nano-Zs90粒子徑分析結(jié)果較為一致。研究結(jié)果表明，酶解后的玉米蛋白由于顆粒減小，疏水性降低，在溶液中分散性和溶解性提高，能夠與葉黃素結(jié)合，對(duì)其負(fù)載形成均一穩(wěn)定的微納米結(jié)構(gòu)和包埋體系，有效提高了葉黃素的分散性和穩(wěn)定性。

圖8 ZL透射電子顯微鏡微觀結(jié)構(gòu)圖

圖9 ZHL透射電子顯微鏡微觀結(jié)構(gòu)圖

3 結(jié)論

研究采用酶法對(duì)玉米蛋白進(jìn)行酶解修飾提高對(duì)葉黃素的負(fù)載性能和包封效率。對(duì)酶解玉米蛋白-葉黃素納米粒的制備工藝條件進(jìn)行了探討，并對(duì)其微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較和分析。研究得到了玉米蛋白負(fù)載葉黃素納米粒的最佳制備工藝條件：在胃蛋白酶濃度15 mg/g、溫度55 ℃、pH 3.0，酶解時(shí)間3 h時(shí)，對(duì)葉黃素包封率最大為96.03%±1.38%，相比修飾前的80.79%±1.05%提高了15.24個(gè)百分點(diǎn)。Nano-Zs90分析儀和透射電鏡分析表明：經(jīng)胃蛋白酶酶解修飾后的玉米蛋白負(fù)載葉黃素納米粒粒徑較小，分散性良好，且對(duì)葉黃素的包封效果提高。因此，采用酶解修飾方法可以提高玉米蛋白作為生物活性成分載體的負(fù)載性能，充分保護(hù)葉黃素在光熱等環(huán)境下的降解和損失，提高其穩(wěn)定性和生物活性，并且有利于增強(qiáng)葉黃素在水溶液中的溶解分散性，對(duì)于葉黃素類脂溶性活性物質(zhì)的體內(nèi)吸收利用和生物活性的發(fā)揮有重要的促進(jìn)作用。