趙楓萍 徐醇芳 嚴(yán)志強(qiáng) 張小琴

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院，上海 201499)

原發(fā)性高血壓是一種復(fù)雜的多因素疾病，其主要發(fā)病機(jī)制之一是外周血管功能和結(jié)構(gòu)異常。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，胞紅蛋白(cytoglobin, Cygb)作為最新發(fā)現(xiàn)的珠蛋白之一，與血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)病理生理機(jī)制的調(diào)控相關(guān)性逐漸引起人們的關(guān)注[1]。高血壓病理性血管重建主要病理特征是VSMCs增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)換和細(xì)胞外基質(zhì)分泌功能活躍[2]。原發(fā)性高血壓引起的大動(dòng)脈重建是一種外向型的肥厚性重建，包括動(dòng)脈內(nèi)腔擴(kuò)大、中膜增厚、膠原沉積、順應(yīng)性降低。其中動(dòng)脈壁增厚被認(rèn)為是維持血管壁應(yīng)力的主要代償機(jī)制之一。本研究觀察胞紅蛋白調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換與高血壓血管重建機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至2020年6月我院實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)12周齡雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g。

1.2方法

1.2.1Cygb在高血壓與正常大鼠頸動(dòng)脈的差異表達(dá) (選取12周齡大鼠30只，分為3組：腎動(dòng)脈縮窄高血壓藥物組、腎動(dòng)脈縮窄高血壓組、正常對(duì)照組；高血壓藥物組大鼠用血管緊張素Ⅱ一型受體(AT1R)拮抗劑阿利沙坦酯灌胃，術(shù)后每天測(cè)定尾動(dòng)脈血壓，血壓升高后給藥使大鼠尾動(dòng)脈血壓降低達(dá)到正常血壓后，每周測(cè)定一次血壓；血壓正常四周后，取頸動(dòng)脈，部分石蠟包埋，部分勻漿后提取蛋白、總RNA。(1)石蠟包埋組織切片后，石蠟包埋切片形態(tài)學(xué)檢測(cè)血管重建指標(biāo)如壁厚，中膜-內(nèi)徑比；免疫組化染色，檢測(cè)Cygb的定位與表達(dá)。(2)提取的蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，檢測(cè)Cygb蛋白在不同血管組織中的表達(dá)水平。(3)提取的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，做熒光定量PCR，檢測(cè)Cygb mRNA的表達(dá)。

1.2.2Cygb對(duì)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的影響 (Ang-II處理培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞：無(wú)菌條件下將四周齡的SD大鼠頸動(dòng)脈取出，仔細(xì)去除動(dòng)脈周圍的結(jié)締組織和外膜，將血管縱向剪開(kāi)，用無(wú)菌棉簽去除內(nèi)膜層的內(nèi)皮細(xì)胞后，再用虹膜剪將血管剪成小于1 mm 3大小的組織塊，置入60 mm的培養(yǎng)皿，貼壁后，添加含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每隔三天換一次液，至細(xì)胞長(zhǎng)出后傳代，用ɑ-actin和SM-22免疫熒光技術(shù)鑒定其純度，純度>95%可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。VSMCs中加入Ang-II(濃度為10-6M/L)；測(cè)定Ang II對(duì)VSMCs增殖和h-caldesmon、(-actin、calponin、SM -22、(和( -tropmyosins以及SM-MHC等表型分子表達(dá)的影響；(Cygb表達(dá)變化對(duì)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的影響：通過(guò)構(gòu)建Cygb過(guò)表達(dá)和RNA干擾慢病毒質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染VSMC來(lái)改變Cygb的表達(dá)狀態(tài)，CCK-8、Edu細(xì)胞增殖試劑盒、流式細(xì)胞儀測(cè)定VSMC的增殖、細(xì)胞周期；RT-PCR、免疫印跡檢測(cè)h-caldesmon、(-actin、calponin、SM -22、(和( -tropmyosins以及SM-MHC等細(xì)胞分化標(biāo)志蛋白和的表達(dá)變化，以及Anxa8、Tpm3h和Retnlb等信號(hào)分子表達(dá)變化。明確Cygb對(duì)VSMC型轉(zhuǎn)換、增殖與分化的作用。

1.2.3在體轉(zhuǎn)染Cygb研究對(duì)高血壓大鼠頸總動(dòng)脈功能及形態(tài)學(xué)研究影響 (1)在體轉(zhuǎn)染高血壓大鼠頸動(dòng)脈Cygb，1月后部分組織用于形態(tài)學(xué)檢測(cè)(方法同上)，部分用于血管電生理檢測(cè)；(2)應(yīng)用wire myography觀察Cygb對(duì)高血壓大鼠頸總動(dòng)脈肌張力變化：a.分離正常對(duì)照的高血壓大鼠、腎性高血壓大鼠和用CYGB慢病毒轉(zhuǎn)染的腎性高血壓大鼠頸總動(dòng)脈，固定于張力電極(具體方法略);b.PSS血管平衡6次，15 min/次，共計(jì)90 min；c.KPSS激活血管三次，間隔5 min/次；d.加入NE(去甲腎上腺素)3.3uL，后加入卡巴膽堿10 mmol/L、100 mmol/L，觀察血管肌張力曲線；e.加入AngII 10-6Mol/L 6uL溫浴30 min后，方法同c，觀察AngII存在條件下血管肌張力曲線；(3)應(yīng)用pressure myography觀察Cygb對(duì)高血壓大鼠頸總動(dòng)脈壓力-直徑變化關(guān)系：a.分離正常對(duì)照的高血壓大鼠、腎性高血壓大鼠和用CYGB慢病毒轉(zhuǎn)染的腎性高血壓大鼠頸總動(dòng)脈，固定于玻璃電極；b.從0～100 mmHg，每10 mmHg遞增壓力梯度，觀察壓力-直徑變化；c.先加入NE(去甲腎上腺素)3.3uL，后加入卡巴膽堿10 mmol/L、100 mmol/L，觀察血管直徑變化時(shí)間曲線；d.先加入AngII 10-6Mol/L 6uL溫浴30 min后，方法同c，觀察AngII存在條件下血管直徑變化時(shí)間曲線。

1.3觀察指標(biāo) 觀察三組大鼠Anxa8、Tpm3、Retn1b mRNA基因表達(dá)變化；觀察正常血壓主動(dòng)脈與高血壓主動(dòng)脈大鼠模型術(shù)后6周血管重建后Cygb mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1觀察三組大鼠Anxa8、Tpm3、Retn1b mRNA基因表達(dá)變化 腎動(dòng)脈縮窄高血壓藥物組、腎動(dòng)脈縮窄高血壓組的Anxa8、Tpm3基因表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，Rentn1b基因表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而腎動(dòng)脈縮窄高血壓藥物組的Anxa8、Tpm3基因表達(dá)顯著低于腎動(dòng)脈縮窄高血壓組，而Ren1b基因表達(dá)顯著高于腎動(dòng)脈縮窄高血壓組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 三組大鼠Anxa8、Tpm3、Retn1b mRNA基因表達(dá)變化

2.2正常血壓主動(dòng)脈與高血壓主動(dòng)脈大鼠模型術(shù)后6周血管重建后Cygb mRNA表達(dá)水平比較 腎性高血壓大鼠模型術(shù)后六周血管重建后Cygb的表達(dá)差異初步研究，發(fā)現(xiàn)與正常血壓主動(dòng)脈組比較，高血壓大動(dòng)脈中Cygb的mRNA表達(dá)下降(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.3比較三組大鼠頸動(dòng)脈Cygb mRNA與中膜厚度指標(biāo) 腎動(dòng)脈縮窄高血壓藥物組、腎動(dòng)脈縮窄高血壓組的Cygb顯著低于正常對(duì)照組，頸動(dòng)脈中膜厚度顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；腎動(dòng)脈縮窄高血壓藥物組的Cygb顯著高于腎動(dòng)脈縮窄高血壓組，而頸動(dòng)脈中膜厚度顯著低于腎動(dòng)脈縮窄高血壓組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 比較三組大鼠頸動(dòng)脈Cygb與中膜厚度指標(biāo)

3 討 論

Cygb研究熱點(diǎn)主要集中在細(xì)胞纖維化與抑制癌組織浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移方面，研究發(fā)現(xiàn)Cygb具有以下功能：清除體內(nèi)活性氧而減少氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)細(xì)胞、組織的損傷[3]；抑制腫瘤，Cygb位于染色體17q25，在惡性腫瘤中經(jīng)常丟失[4]； Cygb啟動(dòng)子甲基化使Cygb表達(dá)沉默，而腫瘤中Cygb啟動(dòng)子甲基化明顯高于正常組織[5]。近年來(lái)，Cygb與心血管疾病的關(guān)系逐漸引起人們的關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)Cygb主要在VSMCs表達(dá)，而血管內(nèi)膜未發(fā)現(xiàn)表達(dá)信號(hào)。Cygb主要可能參與血管平滑肌中的NO代謝[6]。NO產(chǎn)生速率和代謝速率決定了VSMCs內(nèi)NO濃度， Cygb具有NOD 的作用。Cygb在正常有氧的環(huán)境下，Cygb代謝NO的速率較快[7]。當(dāng)體內(nèi)器官或組織缺氧時(shí)， Cygb的mRNA和蛋白水平上調(diào)，NO代謝速率減慢使NO濃度增高，導(dǎo)致血管擴(kuò)張[8]。研究發(fā)現(xiàn)，Cygb基因敲除小鼠血管壁內(nèi)NO代謝降低75%，證實(shí)VSMCs中NO代謝部分依賴于Cygb[9]。Cygb調(diào)控VSMCs中NO濃度， b5R(cytochrome b5 reductase, b5R)是重要的珠紅蛋白還原酶，敲除b5R NO代謝明顯下降，提示VSMCs內(nèi)NO濃度調(diào)控b5R介導(dǎo)有關(guān)。Cygb通過(guò)NO代謝途徑調(diào)控內(nèi)皮依賴性血管舒張與血管張力，成為VSMCs功能的調(diào)控因子。

血管緊張素II(Ang-II)通過(guò)不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，釋放活性氧，激活血管炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)變。早先研究證實(shí)Ang-II參與VSMCs過(guò)氧化物(superoxide)正向合成增加，通過(guò)過(guò)氧化物介導(dǎo)的NO代謝過(guò)程致血管功能受損[10]。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)Cygb能夠矯正Ang-II誘導(dǎo)的高血壓發(fā)生或逆轉(zhuǎn)高血壓病理過(guò)程。有研究分別對(duì)野生小鼠與Cygb基因敲除小鼠采用Ang-II誘發(fā)高血壓模型實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Ang-II對(duì)Cygb基因敲除小鼠不能成功誘發(fā)高血壓，高度提示Cygb表達(dá)下調(diào)NOD進(jìn)而調(diào)節(jié)NO具有預(yù)防高血壓或逆轉(zhuǎn)高血壓的潛在作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)Cygb-/-腸系膜動(dòng)脈壁NO是野生小鼠的3.2倍。Ang-II介導(dǎo)NO代謝是繼發(fā)于過(guò)氧化物而發(fā)揮作用的，而Cygb介導(dǎo)NO代謝減低補(bǔ)償過(guò)氧化物介導(dǎo)的NO代謝增強(qiáng)避免血管功能受損[12]。Cygb參與矯正Ang-II誘導(dǎo)的高血壓發(fā)生或逆轉(zhuǎn)高血壓病理過(guò)程，為高血壓的防治提供了潛在的治療思路。(本文圖1見(jiàn)封三)