門 慧 談 順

肝癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率均呈上升趨勢，死亡率位居第三位[1]，由于起病比較隱匿，大多患者難于早期發(fā)現(xiàn)，直至進展至中晚期才確診。由于缺乏有效的監(jiān)測手段，臨床治療手段如射頻消融、腫瘤切除等都會受到不同程度限制，進而錯過最佳治療時機，嚴(yán)重影響患者預(yù)后及生存[2-3]。

查閱文獻發(fā)現(xiàn)，XAGE-1屬GAGE 家族，2000年，Liu等研究發(fā)現(xiàn)該基因定位于人染色體Xp11.21-Xp11.22上，全長611 bp，包括3個內(nèi)含子和4個外顯子，XAGE-1有4種轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，依次為XAGE-1a、XAGE-1b、XAGE-1c和XAGE-1d，其中XAGE-1a、XAGE-1c 和 XAGE-1d表達譜較窄，XAGE-1b卻具有較廣泛表達譜、表達率及免疫原性而被廣泛研究。XAGE-1b是主要的轉(zhuǎn)錄本存在形式，由于表達模式及序列具有相似性，亦屬于CT(癌-睪丸)抗原家族[4-5]。XAGE-1b在除睪丸、胎盤、腦及卵巢組織以外的正常組織中幾乎不表達[6]，但在腫瘤組織中廣泛表達，XAGE-1b表達見于黑色素瘤[7]、尤文氏肉瘤[4]、肺癌[8-10]、膀胱癌[10]、涎腺腺樣囊性癌[11-12]、胃癌[13]、乳腺癌[13-14]、結(jié)直腸癌[15-16]、前列腺癌[17-18]、肝癌[19-21]。研究發(fā)現(xiàn)XAGE-1b在肝癌的有顯著表達，與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，敏感度大于AFP監(jiān)測[19-21]，但XAGE-1b在肝癌的生物學(xué)作用至今沒有報道。本研究將探討XAGE-1b在肝癌增殖侵襲的作用，為肝癌患者治療提供更深入的靶向依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌細(xì)胞株來自?？谑腥嗣襻t(yī)院，干擾載體購于廣州銳博生物科技有限公司，1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清購于BI生物公司，0.25%消化細(xì)胞胰酶購自Life公司，Matrigel基質(zhì)膠、Boyden小室購于美國BD公司，CCK-8檢測試劑盒購于日本同仁公司，TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購于TaKaRa公司，4 ℃超速離心機購于Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株需要含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液，并放于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)過程中注意無菌操作以及胰酶消化時間，待細(xì)胞狀態(tài)佳時進行實驗。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾載體 XAGE-1b干擾片段(sense,5′-GCTGCATCAGTCAAACACC-3′)，siRNA成品為粉末，先加入250 μl無菌DEPC水配制成10 μM/l工作液置于-20 ℃保存。選取生長狀態(tài)良好細(xì)胞于前一天鋪6孔板，細(xì)胞融合度達50%～70%，細(xì)胞貼壁后使用lipo2000轉(zhuǎn)染，用opti-MEM培養(yǎng)基給細(xì)胞換液1.5 m/孔，配制A液及B液，各250 μl/孔，A液：245 μl optiMEM+5 μl lipo2000，B液：240 μl optiMEM+10 μl SiRNA。A液配好后室溫靜置孵育5 min，加到配好B液中混勻，孵育205 min，將混合液緩慢滴入6孔板中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h，更換含10%血清培基培養(yǎng)，24～48 h后提取RNA。

1.2.3 熒光定量PCR 培養(yǎng)細(xì)胞至細(xì)胞鋪滿瓶底，先吸出培養(yǎng)基，再用PBS洗1～2次，加入1 ml Trizol試劑進行冰上裂解(5 min)，吹打細(xì)胞，再加入氯仿(0.2 ml氯仿/1 ml trizol)混勻吹打細(xì)胞，再冰上裂解2～3 min，將裂解液收集EP管中，4 ℃、12 000 rpm離心機離心15 min，吸取上層水相移并移至去酶的1.5 ml EP管，在剩余沉淀中加入等體積異丙醇，在室溫中靜置10 min，4 ℃、12 000 rpm離心機離心10 min，去除上清，留沉淀，沉淀物用已處理過的DEPC水配制成的75%乙醇進行洗滌，4 ℃、12 000 rpm離心機離心5 min，重復(fù)1遍，室溫放置至沉淀自然干燥，加入適量DEPC水溶解RNA，測RNA濃度，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):把所需逆轉(zhuǎn)錄試劑先上下輕顛混勻，小型離心機離心30 s，然后放于冰上備用。按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行配制反應(yīng)體系，在PCR儀中37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃滅活5 min，進行逆轉(zhuǎn)錄，用DEPC水稀釋逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物約4倍，-20 ℃保存。第二天進行熒光定量PCR反應(yīng)，PCR引物序列：(upstream-primer:5'TACTGAGACACGGCGGAC3';down-streamprimers:5'TTCCATGTCGCGCACTG3')，按照TaKaRaRT-PCR試劑盒說明書進行配制反應(yīng)體系，在QPCR儀中依次95 ℃預(yù)變性10 min、95 ℃ 15 sec、60 ℃約30 sec、72 ℃ 34 sec，40個循環(huán)數(shù)。于7500 Fast Real-Time PCR儀取得各模板Ct值，我們采用Folds=2-ΔΔCt值代表基因表達，按照計算公式△△Ct=Ct(實驗組)-Ct(對照組)實驗重復(fù)3次。

1.2.4 CCK8細(xì)胞增殖實驗 選用細(xì)胞狀態(tài)良好癌細(xì)胞進行實驗，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗1～2次，0.25%胰酶消化細(xì)胞，把細(xì)胞收集于無菌EP管，置于900 rp離心機離心4 min，棄掉培養(yǎng)基，空培洗滌細(xì)胞2次，用空培重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度，計數(shù)板計數(shù)，按照每孔1×103個細(xì)胞接種至96孔板并每孔體積100 μl，同時再設(shè)5個復(fù)孔/每組以及1個blank對照孔(僅加培養(yǎng)基)，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天；在鋪板24 h后即測第一天OD值，步驟：棄掉培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清1640液與CCK8試劑混合液(10∶1)，110 μl/每孔(避光操作)，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2小時后取出96孔板，在酶標(biāo)儀進行測值，先將blank對照孔調(diào)零，再檢測每個孔450 nm處吸光度值(OD值)，OD比值象征細(xì)胞增殖能力，每組所設(shè)5個復(fù)孔平均值，依次連測7天，最后繪制增殖曲線。

1.2.5 Boyden小室細(xì)胞侵襲實驗 選用細(xì)胞狀態(tài)良好癌細(xì)胞進行實驗，先將小室預(yù)處理，濾膜上鋪基質(zhì)膠(RPMI-1640液稀釋的Matrigel基質(zhì)膠按照1∶5混合)，50 μl配置膠/小室，整個操作需在冰上進行，迅速把小室置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱2～3 h(使膠發(fā)生凝固)，然后置于超凈臺紫外照射2 h進行殺菌，再加入適量空培并在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h(水化)，在超凈臺中吸出上室中用于水化培養(yǎng)液，下室內(nèi)加入600 μl含10%胎牛血清1640液，最后在上室中加入200 μl細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)200×103個)，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～72 h(目的使細(xì)胞進行穿膜運動)，取出小室輕輕擦掉上室內(nèi)未穿過細(xì)胞(棉花或棉棒)，PBS液輕輕洗小室3次(避免用力)，甲醇液固定20～30 min，PBS液輕輕洗3次，蘇木精染液染色40 min，鏡下觀察穿過膜細(xì)胞數(shù)，選取上、下、左、右、中心5個視野200倍光鏡下拍圖，細(xì)胞計數(shù)取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用Graphpad Prism 6統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組均數(shù)間的比較采用配對樣本t檢驗，多組均數(shù)間比較采用方差分析法，取α=0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 QPCR檢測肝癌細(xì)胞株中XAGE-1b內(nèi)源性表達

熒光定量Q-PCR檢測3株肝癌細(xì)胞株7721、97H、HepG2中XAGE-1b的mRNA表達水平，XAGE-1b的表達水平由高至低依次為7721、HepG2、97H(圖1)。

圖1 QPCR檢測3株肝癌細(xì)胞株中XAGE-1b的mRNA內(nèi)源性表達情況

2.2 QPCR檢測干擾載體的干擾效率

QPCR檢測XAGE-1b干擾載體感染7721細(xì)胞后XAGE-1b的mRNA表達水平，與NC組相比，SI組mRNA水平顯著降低(P<0.01，圖2)。

圖2 QPCR檢測XAGE-1b的干擾效率

2.3 CCK8檢測XAGE-1b干擾后對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響

與NC組相比，7721SI組細(xì)胞株增殖率明顯降低(P<0.01，圖3)。結(jié)果表明，XAGE-1b干擾組增殖能力明顯降低，干擾XAGE-1b抑制腫瘤細(xì)胞的體外增殖能力。

圖3 CCK8檢測XAGE-1b干擾后7721細(xì)胞株的體外增殖情況

2.4 Boyden小室細(xì)胞侵襲實驗檢測XAGE-1b干擾后對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響

與NC組相比，7721SI組細(xì)胞穿過小室膜數(shù)目顯著減少(P<0.01，圖4)。結(jié)果表明，干擾XAGE-1b抑制腫瘤細(xì)胞的體外侵襲能力。

圖4 Boyden小室細(xì)胞侵襲實驗檢測XAGE-1b干擾后7721細(xì)胞株體外侵襲情況

3 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是常見的死亡原因，由于起病比較隱匿，難于早期發(fā)現(xiàn)，因此采取有效的監(jiān)測手段是早發(fā)現(xiàn)早治療的關(guān)鍵。XAGE-1b因具有較廣泛表達譜、表達率及免疫原性而被廣泛研究，XAGE-1b的血漿mRNA及蛋白可作為腫瘤標(biāo)記協(xié)助臨床診斷[20]。

XAGE-1屬于GAGE 家族，有4種轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，依次為XAGE-1a、XAGE-1b、XAGE-1c 和 XAGE-1d，XAGE-1b是主要的轉(zhuǎn)錄本存在形式。XAGE-1b在除睪丸、胎盤、腦及卵巢組織以外的正常組織中幾乎不表達，但在腫瘤組織中廣泛表達，見于黑色素瘤、尤文氏肉瘤、胃癌、涎腺腺樣囊性癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌等多腫瘤中，在生物學(xué)功能方面，XAGE-1b可以促進涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成[22]。XAGE-1b在肝癌中亦有表達且與患者預(yù)后相關(guān)，但其在肝癌中的生物學(xué)行為至今沒有研究。

本研究我們通過QPCR檢測3株肝癌細(xì)胞株XAGE-1b的mRNA內(nèi)源性表達情況，選取表達量最高1株肝癌細(xì)胞株7721進行研究，采用XAGE-1b干擾載體轉(zhuǎn)染7721細(xì)胞株，QPCR檢測XAGE-1b的mRNA干擾效率，然后采用CCK8細(xì)胞增殖實驗、Boyden小室細(xì)胞侵襲實驗進行體外生物學(xué)作用分析，發(fā)現(xiàn)干擾XAGE-1b能夠抑制肝癌細(xì)胞體外增殖、侵襲能力，說明XAGE-1b表達與肝癌的增殖、侵襲能力密切相關(guān)。

本研究結(jié)果表明，沉默XAGE-1b后肝癌細(xì)胞的體外增殖、侵襲能力明顯降低，但XAGE-1b的相關(guān)作用機制仍不清楚，有待進一步深入研究。XAGE-1b有望成為腫瘤標(biāo)記物的篩查指標(biāo)，為臨床腫瘤診治及新藥研究提供新的靶點依據(jù)，進一步提高患者生存質(zhì)量。