張耿武，陳俊平，黃潔靖

（1廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院藥劑科 廣東 廣州 510006）

（2廣州市醫(yī)藥職業(yè)學(xué)校 廣東 廣州 510430）

蒼耳子（Fructus Xanthii）為菊科植物蒼耳（Xanthium sibiricum Patr.Et Widd.）的干燥成熟帶種皮的果實(shí)[1]，化學(xué)成分主要有脂肪酸、倍半萜內(nèi)酯、水溶性二萜苷、噻嗪雙酮以及酚酸等，臨床上常用的中藥，具有抗炎、抗菌等作用，經(jīng)藥理學(xué)證明其含有的綠原酸、咖啡酸等酚類化合物為其主要的活性成分，綠原酸發(fā)揮抗炎作用[2]。蒼耳子在全國各地均有生長，本文對(duì)4個(gè)不同地區(qū)的蒼耳子綠原酸含量進(jìn)行研究，旨在為控制蒼耳子質(zhì)量，合理應(yīng)用蒼耳子提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.儀器與試藥

儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀；sartornus 電子天平(十萬分之一)；DHG-9005電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒股份有限公司）；DS10260超聲波清洗器(天津市東康科技有限公司)；試劑：邁瑞達(dá)甲醇（色譜純）；分析純磷酸（北京化工）；屈臣氏水；對(duì)照品：綠原酸（中國藥品生物制品檢驗(yàn)所）；樣品：山東蒼耳子（山東棗莊）、河北蒼耳子（河北保定）、吉林蒼耳子（吉林長春）、四川蒼耳子（四川成都）均于各地采用。

2.實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水[3]，梯度洗脫（0～30 min，甲醇15%→45%），流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長254 nm，進(jìn)樣體積20 ul。

2.2 溶液的配制

2.2.1對(duì)照品貯備溶液

將購買的綠原酸對(duì)照品在60 ℃的干燥箱中干燥2 h后備用。精密稱取綠原酸20.12 mg置20 mL量瓶中，用75%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。

2.2.2對(duì)照品溶液

精密稱取對(duì)照品貯備液1.0 mL置20 mL量瓶中，用75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.2.3供試品溶液

將四個(gè)產(chǎn)地的蒼耳子自然晾干后分別粉碎過4號(hào)篩備用。取粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入75%的甲醇超聲[4]提取1 h，濾取濾液，并定容置50 mL量瓶中，用75%甲醇稀釋至刻度，搖勻即得供試品溶液。

2.3 專屬性考察

取75%甲醇、對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“2.1”條色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果表明75%甲醇對(duì)樣品檢測(cè)無干擾，供試品溶液綠原酸出峰位置無其他雜質(zhì)干擾。表明該色譜條件專屬性好。見圖1、圖2。

圖1 綠原酸對(duì)照品色譜圖

圖2 蒼耳子樣品色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品貯備溶液1.0 mL、2.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、1.0 mL、1.0 mL分別置10 mL、25 mL、20 mL、50 mL、50 mL、100 mL量瓶中，用75%乙醇稀釋至刻度，混勻，得到對(duì)照品系列溶液Ⅰ～VI。按上述“2.1”條色譜條件進(jìn)樣分析。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明綠原酸在濃度10.06 ～100.60 ug/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品貯備液溶液1.0 mL置20 mL量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”條色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果綠原酸峰面積的RSD=0.45%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 定量限和檢測(cè)限

將“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液用75%逐級(jí)稀釋進(jìn)樣，當(dāng)信噪比S/N=10時(shí)，為檢測(cè)限濃度，當(dāng)信噪比S/N=3時(shí)為檢測(cè)限濃度，結(jié)果檢測(cè)限S/N=12.2，靈敏度為0.010%，定量限S/N=3.5，靈敏度為0.003%，表明該法靈敏度高，供試品濃度滿足本品中綠原酸檢測(cè)。

2.7 重復(fù)性

取河北保定同一批樣品按照“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液配制方法配制樣品，平行6份，并平行配制2份100%濃度得標(biāo)準(zhǔn)溶液，各精密量取20 ul進(jìn)進(jìn)樣，按外標(biāo)法測(cè)定樣品中綠原酸含量，并對(duì)6次測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，來評(píng)價(jià)方法的重復(fù)性。結(jié)果樣品中綠原酸含量平均值為0.02%，RSD=1.32%，表明河北保定同一批樣品6次結(jié)果測(cè)定值基本一致，方法重復(fù)性好。

2.8 加樣回收率

精密稱取河北保定9份同一批樣品0.5g，分別加入一定量的對(duì)照品，按照“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液配制方法配制樣品。按“2.1”條色譜條件進(jìn)樣分析結(jié)果見表1。

表1 綠原酸加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=9）

結(jié)論：由結(jié)果可知，綠原酸的平均回收率均在90%～110%之間，RSD%小于5，說明本方法準(zhǔn)確度高。

2.9 樣品測(cè)定

取河北保定、山東棗莊、吉林長春和四川成都采用的蒼耳子藥材分別按“2.2”項(xiàng)下溶液配制方法，按“2.1”條色譜條件進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法計(jì)算4個(gè)不同城市蒼耳子綠原酸含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果（%）

3.討論

對(duì)不同產(chǎn)地的蒼耳子綠原酸檢測(cè)，結(jié)果表明山東棗莊綠原酸含量較高，從變化趨勢(shì)上看綠原酸檢出量山東棗莊＞吉林長春＞四川成都＞河北保定，整體比較差異不大。色譜條件確定后對(duì)方法的耐用性進(jìn)行了考察，在流速、柱溫、流動(dòng)相比例微小變動(dòng)后，樣品檢測(cè)結(jié)果不受影響，表明該方法適用性好。本文樣品處理采用的是75%甲醇超聲提取1 h，對(duì)供試品制備方法篩查中曾采用30%甲醇、50%甲醇、75%甲醇和水作為溶劑，用加熱回流提取法[5-6]、超聲提取法和索氏提取法，篩查結(jié)果以75%甲醇超聲提取更方便和有效提取率高。不同產(chǎn)地蒼耳子其他成分在質(zhì)量上的區(qū)別有待于進(jìn)一步研究。