孫群周 (河南省洛陽正骨醫(yī)院 河南省骨科醫(yī)院綜合骨一科，河南 洛陽 471000)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，臨床表現(xiàn)多為關(guān)節(jié)軟骨退化、骨刺形成、關(guān)節(jié)間隙變窄等，同時伴隨關(guān)節(jié)畸形、僵硬、腫脹、疼痛等癥狀，多發(fā)于中老年人〔1〕。普遍認(rèn)為，衰老、遺傳、肥胖、炎癥和關(guān)節(jié)損傷是OA發(fā)病的主要原因，但其發(fā)病機(jī)制目前尚未明確〔2，3〕。隨著人口老齡化的加劇，OA發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，同時給患者及其家庭、社會造成了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)〔4〕。OA的臨床治療以非甾體類抗炎藥、透明質(zhì)酸注射等藥物治療及關(guān)節(jié)置換術(shù)、軟骨修復(fù)術(shù)等手術(shù)治療為主，用以抗炎和減輕疼痛，至今沒有根治之法〔5〕。報道指出，中藥能夠減輕患者疼痛、抑制炎癥反應(yīng)、改善關(guān)節(jié)功能，從而延緩OA進(jìn)程〔6〕。多糖是一類由超過10個單糖通過糖苷鍵聚合而成的高分子糖類物質(zhì)，是多種中藥材的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗菌消炎、降血糖、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，可用于神經(jīng)退行性疾病、腫瘤等多種疾病的治療〔7～9〕。研究表明，狗脊多糖(CBPS)能夠通過促進(jìn)細(xì)胞周期刺激軟骨細(xì)胞增殖〔10〕。本研究通過檢測CBPS對白細(xì)胞介素(IL)-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖和凋亡及細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討其干預(yù)OA的潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 OA軟骨組織來源于河南省洛陽正骨醫(yī)院骨關(guān)節(jié)炎置換患者，手術(shù)經(jīng)患者知情同意。胎牛血清(批號：10099-141)、DMEM培養(yǎng)基(批號：31053028)、胰蛋白酶(批號：20230)、pcDNA 3.1(批號：K480001)購自美國Thermo Fisher公司；Trizol試劑(批號：15596)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(批號：BSP0161)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液(批號：PE0030)、RIPA裂解液(批號：R0020)、二甲基亞砜(DMSO，批號：D8370)、Ⅱ型膠原蛋白酶(批號：C8150)購自北京Solarbio公司；噻唑藍(lán)(MTT，批號：M2129)、PI(批號：D4543)購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(批號：170207)購自美國Coulter公司；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：RR047A)、TaKaRa實時熒光定量試劑盒(批號：RR820A)購自寶生物工程(大連)有限公司；兔抗腫瘤壞死因子(TNF)-α(批號：ab6671)、金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1(批號：ab38978)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13(批號：ab39012)、β-actin(批號：ab8227)多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(批號：ab6721)購自美國Abcam公司；control mimics、miR-181c mimics、control inhibitors、miR-181c inhibitors購自美國Invitrogen公司；MCO-18AC型CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司；CFX96 Touch TM熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測系統(tǒng)、ChemiDoc TM MP凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀購自上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；HBS-1096B型酶標(biāo)儀購自南京德鐵實驗設(shè)備公司。

1.2OA軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將獲得的OA軟骨組織放入含100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的D-Hanks液中，無菌條件下刮除關(guān)節(jié)周圍附著組織并清洗軟骨組織，使用眼科剪剪碎組織；2.5 g/L胰蛋白酶消化30 min后棄去培養(yǎng)基，加入2 g/LⅡ型膠原蛋白酶(使用含100 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋)，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中孵育；待軟骨組織基本完全消化，培養(yǎng)基變混濁收集培養(yǎng)基，輕輕吹打后4℃、800 r/min離心5 min，棄上清；洗滌后，使用含100 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、CO2條件下培養(yǎng)。每隔2 d 更換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞匯合度約85%時進(jìn)行傳代，取第2代軟骨細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3實驗分組 將OA軟骨細(xì)胞以1×104個/孔接種于96孔板，隨機(jī)分為Control組、IL-1β組、miR-con組、miR-181c組、IL-1β+miR-con組、IL-1β+miR-181c組、IL-1β+PBS組、IL-1β+CBPS組、磷酸鹽緩沖液(PBS)組、CBPS組、CBPS+anti-miR-con組、CBPS+anti-miR-181c組，每組6個復(fù)孔。處理方法：Control組：未做處理的細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)；IL-1β組：在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入IL-1β并調(diào)整終濃度為10 ng/ml；miR-con組：轉(zhuǎn)染control mimics的細(xì)胞；miR-181c組：轉(zhuǎn)染miR-181c mimics的細(xì)胞；IL-1β+miR-con組：轉(zhuǎn)染control mimics的細(xì)胞使用含10 ng/ml IL-1β的培養(yǎng)基培養(yǎng)；IL-1β+miR-181c組：轉(zhuǎn)染miR-181c mimics的細(xì)胞使用含10 ng/ml IL-1β的培養(yǎng)基培養(yǎng)；IL-1β+CBPS組：使用含終濃度為10 ng/ml IL-1β和200 μg/ml CBPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)；IL-1β+PBS組：在含終濃度為10 ng/ml IL-1β的培養(yǎng)基中加入與CBPS等量的PBS進(jìn)行培養(yǎng)；CBPS組：使用含200 μg/ml CBPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)；PBS組：在培養(yǎng)基中加入與CBPS等量的PBS進(jìn)行培養(yǎng)；CBPS+anti-miR-con組：轉(zhuǎn)染control inhibitors的細(xì)胞使用含終濃度為10 ng/ml IL-1β和200 μg/ml CBPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)；CBPS+anti-miR-181c組：轉(zhuǎn)染miR-181c inhibitors的細(xì)胞使用含終濃度為10 ng/ml IL-1β和200 μg/ml CBPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)；CBPS濃度參考文獻(xiàn)〔11〕。

轉(zhuǎn)染方法：接種至96孔板的軟骨細(xì)胞生長至融合度約45%時，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將稀釋好的control mimics、miR-181c mimics、control inhibitors、miR-181c inhibitors分別與Lipofectamine 2000混合并加入到96孔板中，孵育6 h后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.4qRT-PCR 收集Control組、IL-1β組、IL-1β+PBS組、IL-1β+CBPS組細(xì)胞，Trizol法提取總RNA。檢測RNA濃度和純度，使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，TaKaRa熒光定量試劑盒配制反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參，置于實時熒光定量儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個RNA樣品重復(fù)3次，mRNA相對表達(dá)量的計算采用2-△△Ct法。β-actin引物：上游：5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAA AG-3′，下游：5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′；miR-181c引物：上游：5′-AACATTCAACCTGTCGGTGAGT-3′，下游：5′-GCAACATTCAACCTGTCGG-TG-3′。

1.5MTT 分別在Control組、IL-1β組、IL-1β+miR-con組、IL-1β+miR-181c組、IL-1β+PBS組、IL-1β+CBPS組、PBS組、CBPS組、CBPS+anti-miR-con組、CBPS+anti-miR-181c組培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時，每孔加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μl DMSO振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。

1.6細(xì)胞凋亡檢測 取生長狀態(tài)良好的IL-1β+miR-con組、IL-1β+miR-181c組、IL-1β+PBS組、IL-1β+CBPS組、PBS組、CBPS組、CBPS+anti-miR-con組、CBPS+anti-miR-181c組細(xì)胞，胰酶消化后4℃、300 g離心收集。按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，分別加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.7Western印跡 收集PBS組、CBPS組、CBPS+anti-miR-con組、CBPS+anti-miR-181c組細(xì)胞，中加入RIPA裂解液裂解后，4℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清液。將蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)至PVDF

膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入兔抗TNF-α(1∶500)、TIMP-1(1∶1 000)、MMP-13(1∶5 000)和β-actin(1∶1 000)多克隆抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌；ECL發(fā)光顯影，每個蛋白樣品重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1IL-1β抑制軟骨細(xì)胞中miR-181c表達(dá) 經(jīng)IL-1β組miR-181c表達(dá)水平(0.41±0.06)明顯低于Control組(1.00±0.14，t=6.709，P=0.000)。

2.2過表達(dá)miR-181c抑制IL-1β對軟骨細(xì)胞增殖的抑制和凋亡的促進(jìn)作用 IL-1β組48 h及72 h細(xì)胞活力均明顯低于Control組，而細(xì)胞凋亡率明顯高于Control組(均P<0.05)；miR-181c組miR-181c表達(dá)水平(4.72±0.35)明顯高于miR-con組(1.06±0.12，P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測軟骨細(xì)胞凋亡

組別細(xì)胞活力(OD490)24 h48 h72 h細(xì)胞凋亡率(%)Control組0.28±0.030.58±0.050.86±0.084.44±0.38IL-1β組0.25±0.040.32±0.031)0.52±0.051)32.06±1.861)IL-1β+miR-con組0.26±0.030.33±0.030.51±0.0634.26±2.06IL-1β+miR-181c組0.27±0.040.49±0.062)0.70±0.062)15.35±1.052)F/P值0.400/0.75724.405/0.00020.640/0.000269.581/0.000

2.3CBPS可逆轉(zhuǎn)IL-1β對軟骨細(xì)胞中miR-181c表達(dá)的抑制作用 與Control組(1.00±0.08)相比，IL-1β組miR-181c表達(dá)水平(0.35±0.05)顯著降低(P<0.05)，IL-1β+miR-181c組miR-181c表達(dá)水平(0.81±0.11)明顯高于IL-1β+miR-con(0.38±0.07，P<0.05)，基本恢復(fù)至正常水平。

2.4CBPS聯(lián)合IL-1β對軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響 IL-1β組48 h及72 h細(xì)胞活力均明顯低于Control組，而細(xì)胞凋亡率均明顯高于Control組(均P<0.05)；IL-1β+CBPS組48 h及72 h細(xì)胞活力均明顯高于IL-1β+PBS組，而細(xì)胞凋亡率均明顯低于IL-1β+PBS組(均P<0.05)。見表2。

表2 miR-181c和IL-1β對軟骨細(xì)胞活力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

2.5下調(diào)miR-181c表達(dá)抑制CBPS和IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖和凋亡 IL-1β+CBPS組48 h、72 h細(xì)胞活力顯著高于IL-1β+PBS組，細(xì)胞凋亡率顯著低于IL-1β+PBS組(P<0.05)；IL-1β+CBPS+anti-miR-181c組48 h、72 h細(xì)胞活力顯著低于IL-1β+CBPS+anti-miR-con組，細(xì)胞凋亡率顯著高于IL-1β+CBPS+anti-miR-con組(P<0.05)。見表3。

組別細(xì)胞活力(OD490)24 h48 h72 h凋亡率(%)TNF-αTIMP-1MMP-13IL-1β+PBS組0.26±0.030.31±0.030.51±0.0532.16±2.880.57±0.050.62±0.040.72±0.06IL-1β+CBPS組0.28±0.030.53±0.041)0.72±0.061)13.25±1.451)0.21±0.031)1.31±0.081)0.32±0.041)IL-1β+CBPS+anti-miR-con組0.27±0.040.56±0.050.74±0.0511.87±1.810.18±0.041.34±0.070.30±0.04IL-1β+CBPS+anti-miR-181c組0.25±0.030.40±0.042)0.62±0.042)20.58±2.652)0.48±0.072)0.71±0.052)0.44±0.062)F值0.46524.60620.28852.55245.818114.31243.192P值0.7150.0000.0000.0000.0000.0000.000

2.6miR-181c和CBPS對IL-1β介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞TNF-α、TIMP-1和MMP-13水平的影響 IL-1β+CBPS組TNF-α及MMP-13水平明顯低于IL-1β+PBS組，而TIMP-1水平明顯高于IL-1β+PBS組(均P<0.05)；IL-1β+CBPS+anti-miR-181c組TNF-α及MMP-13水平均明顯高于IL-1β+CBPS+anti-miR-con組，而TIMP-1水平明顯低于IL-1β+CBPS+anti-miR-con組(均P<0.05)。見表3、圖2。

1～4：IL-1β+PBS組、：IL-1β+CBPS組、：IL-1β+CBPS+anti-miR-con組、：IL-1β+CBPS+anti-miR-181c組圖2 Western印跡檢測軟骨細(xì)胞TNF-α、TIMP-1和MMP-13水平的影響

3 討 論

中藥狗脊是蚌殼蕨科金毛狗屬植物金毛狗脊的干燥根莖，其性溫，味苦，包含皂苷類、黃酮類、酚酸類、糖及糖苷類、揮發(fā)油類等多種化學(xué)成分，廣泛應(yīng)用于手足麻木、腰腿酸痛、偏癱等癥的臨床治療〔12〕。據(jù)報道，CBPS能夠通過改善血液循環(huán)降低骨內(nèi)壓；提高超氧化物歧化酶(SOD)活性并降低氧自由基含量，從而發(fā)揮抗氧化作用；促進(jìn)G1/S周期轉(zhuǎn)化而加快軟骨細(xì)胞增殖，已廣泛應(yīng)用于OA的預(yù)防及治療〔13〕。而CBPS已被證實能夠通過上調(diào)細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白D水平，加速細(xì)胞從G1向S期轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖〔10〕。此外，付長龍等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，CBPS可有效降低軟骨細(xì)胞液中丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量，同時上調(diào)SOD表達(dá)，具有抗氧化作用。

miRNA是一類長度19～22 nt的內(nèi)源性非編碼RNA分子，能夠通過與靶mRNA 3′UTR區(qū)互補序列特異性結(jié)合使其降解或抑制其翻譯過程，從而調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞的生長分化、凋亡和機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程〔14〕。多項研究表明，miRNA能夠調(diào)節(jié)IL-1β、TNF-α、MMP-13等的分泌，促進(jìn)或抑制OA發(fā)展〔15～17〕。TNF-α是由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可刺激IL-33分泌，從而增加IL-6水平，促進(jìn)炎癥反應(yīng)〔18〕。MMP-13是MMP家族中的重要成員，能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)參與膠原的形成，而軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)主要由膠原、蛋白聚糖和水組成，MMP-13則通過降解Ⅱ型膠原破壞軟骨組織，加速OA進(jìn)程〔19，20〕。

人miR-181由miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d 4個高度保守的成員組成，在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞中具有介導(dǎo)抗炎的功能，并且能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞發(fā)育和B細(xì)胞分化，參與炎癥和免疫反應(yīng)〔21，22〕。其中，miR-181c在OA組織中表達(dá)下調(diào)，miR-181c異位表達(dá)能夠顯著降低MMP-13、IL-6和IL-8水平和滑膜細(xì)胞的過度增殖，發(fā)揮抗炎作用〔23〕；并且能夠通過降低IL-1β和TNF-α水平，減輕燒傷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)〔24〕。TIMP-1是一種具有MMP活性抑制作用的多功能因子，對除MMP-14、MMP-16、MMP-19和MMP-24外的MMP具有明顯的抑制作用〔25〕。本研究結(jié)果提示miR-181c與OA炎癥反應(yīng)有關(guān)。在IL-1β干預(yù)條件下，下調(diào)軟骨細(xì)胞中miR-181c表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)200 μg/ml CBPs對細(xì)胞增殖的促進(jìn)和凋亡的抑制作用，并恢復(fù)細(xì)胞中TNF-α、TIMP-1和MMP-13蛋白表達(dá)水平。