王洪偉 林娟 (海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，海南 海口 570311)

宮頸癌是女性第二大常見惡性腫瘤，更是導(dǎo)致女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因〔1，2〕。目前，隨著手術(shù)、放化療等診療手段的不斷進(jìn)展，宮頸癌的診療取得一定效果，但由于腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，宮頸癌患者的長期生存率仍不理想。因此，迫切需要探索宮頸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度超過200個(gè)核苷酸非編碼RNA，沒有或僅有有限的蛋白編碼潛能〔3〕。研究表明，LncRNA通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和存活從而發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用〔4〕。溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員4A1反義RNA1(SLCO4A1-AS1)是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)LncRNA，其在結(jié)腸癌中發(fā)揮致癌基因作用，敲減SLCO4A1-AS1在體外可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)抑制腫瘤的生長〔5〕。但目前并無SLCO4A1-AS1和宮頸癌的相關(guān)報(bào)道。miR-876-3p是一種抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)miR-876-3p在胰腺癌中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-876-3p可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移〔6〕。生物信息學(xué)分析顯示，miR-876-3p是SLCO4A1-AS1的潛在靶基因，但SLCO4A1-AS1能否調(diào)控miR-876-3p表達(dá)進(jìn)而影響宮頸癌的生物學(xué)行為尚未可知。因此，本研究旨在探討SLCO4A1-AS1對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并初步探討其可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 宮頸癌細(xì)胞(SiHa、HeLa、C33a、Caski)和正常的永生化宮頸上皮細(xì)胞系Ect1/E6E7均購自美國ATCC；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；si-con、si-SLCO4A1-AS1、miR-con、miR-876-3p mimics、anti-miR-con、anti-miR-876-3p、pcDNA、pcDNA-SLCO4A1-AS1、WT-SLCO4A1-AS1、MUT-SLCO4A1-AS1的構(gòu)建測序及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物均購自上海生工公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR試劑盒均購自大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購自美國APExBIO公司；Transwell小室和基質(zhì)膠均購自美國Corning公司產(chǎn)品；TRIzol試劑、放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液、Western洗滌液、Western封閉液、硝酸纖維素(NC)膜、辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔的Ⅱ抗均購自中國碧云天公司；兔源細(xì)胞周期素(Cyclin)D1抗體、兔源P21抗體、兔源基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、兔源MMP-9抗體、兔源GAPDH抗體均購自美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組 采用RPMI1640培養(yǎng)基分別培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞和正常宮頸細(xì)胞，培養(yǎng)基中均添加10%的胎牛血清，在37℃，含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組：本實(shí)驗(yàn)選取HeLa細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究，將HeLa細(xì)胞隨機(jī)分為NC組(正常培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞)、si-con組(轉(zhuǎn)染si-con)、si-SLCO4A1-AS1組(轉(zhuǎn)染si-SLCO4A1-AS1)、miR-con組(轉(zhuǎn)染miR-con)、miR-876-3p組(轉(zhuǎn)染miR-876-3p mimics)、si-SLCO4A1-AS1+anti-miR-con組(共轉(zhuǎn)染si-SLCO4A1-AS1和anti-miR-con)和si-SLCO4A1-AS1+ anti-miR-876-3p組(共轉(zhuǎn)染si-SLCO4A1-AS1和anti-miR-876-3p)。轉(zhuǎn)染方法嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000使用說明書進(jìn)行。

1.2.2qRT-PCR檢測 采用TRIzol試劑分別提取4種宮頸癌細(xì)胞和正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，以cDNA為擴(kuò)增模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。分別以U6和β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-876-3和SLCO4A1-AS1的相對表達(dá)水平。

1.2.3雙熒光素酶報(bào)告基因檢測 采用生物信息軟件starbase在線預(yù)測SLCO4A1-AS1的靶基因，發(fā)現(xiàn)SLCO4A1-AS1和miR-876-3存在部分連續(xù)互補(bǔ)的核苷酸序列。隨后對二者的靶向關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。構(gòu)建野生型WT-SLCO4A1-AS1和突變型MUT-SLCO4A1-AS1的SLCO4A1-AS1-3′UTR熒光素酶報(bào)告基因載體，分別將WT-SLCO4A1-AS1和突變型MUT-SLCO4A1-AS1與miR-876-3 mimics或miR-con共轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.2.4MTT法檢測細(xì)胞活力 采用MTT法檢測細(xì)胞活力，將HeLa細(xì)胞按照2×103個(gè)/孔(200 μl)接種到96孔板，進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染后，分別于轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h時(shí)向每孔內(nèi)添加20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μl的DMSO，搖床震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度值。

1.2.5Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力 侵襲實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染48 h時(shí)消化細(xì)胞，離心棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，采用不含血清的RPMI1640重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度約為1×106個(gè)/ml。取200 μl細(xì)胞懸液加入鋪有基質(zhì)膠的Transwell上室內(nèi)，向下室加入500 μl含10%血清的RPMI1640培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，用甲醇固定下室膜30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用33%醋酸脫色后，倒置于顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)視野，記錄細(xì)胞總數(shù)，拍照，取其均值即為侵襲細(xì)胞數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)采用未鋪有基質(zhì)膠的小室，其他步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.2.6Western印跡檢測 使用RIPA裂解液各組細(xì)胞，收集蛋白樣品，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)液，按照1∶1比例將蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液(2×)混合，沸水浴加熱3～5 min，以充分變性蛋白。冷卻到室溫后，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔。停止電泳后，用標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜，轉(zhuǎn)膜完畢后，立即用Western洗滌液洗膜2 min，滴管吸盡洗滌液，加入Western封閉液室溫?fù)u床封閉1 h，吸盡封閉液后，立即加入稀釋好的Ⅰ抗室溫?fù)u床孵育1 h，Western洗滌液洗膜3次(5 min/次)，加入相應(yīng)的已稀釋二抗室溫?fù)u床孵育1 h，再次用Western洗滌液洗膜后，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色試劑在暗室內(nèi)顯色，Image J分析目的條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1宮頸癌細(xì)胞系中SLCO4A1-AS1和miR-876-3p的表達(dá) 與Ect1/E6E7組相比，其余各組SLCO4A1-AS1表達(dá)水平均顯著升高，miR-876-3p表達(dá)水平均顯著降低(均P<0.05)。選取SLCO4A1-AS1表達(dá)水平升高和miR-876-3p表達(dá)水平降低最明顯的HeLa細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。見表1。

表1 宮頸癌細(xì)胞系中SLCO4A1-AS1和miR-876-3p的表達(dá)

2.2沉默SLCO4A1-AS1對宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖的影響 與NC組和si-con組比較，si-SLCO4A1-AS1組HeLa細(xì)胞SLCO4A1-AS1的表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，表明沉默SLCO4A1-AS1的宮頸癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。與NC組和si-con組比較，si-SLCO4A1-AS1組HeLa細(xì)胞p21蛋白表達(dá)水平顯著升高，CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞增殖活力顯著降低(均P<0.05)，見圖1、表2。提示沉默SLCO4A1-AS1抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖能力。

圖1 檢測宮頸癌細(xì)胞HeLa中p21和CyclinD1蛋白的表達(dá)

組別SLCO4A1-AS1細(xì)胞活力(OD490 nm)24 h48 h72 hp21CyclinD1NC組1.00±0.110.36±0.040.65±0.081.12±0.110.57±0.070.79±0.08si-con組0.97±0.090.35±0.050.63±0.071.08±0.090.61±0.050.81±0.09si-SLCO4A1-AS1組0.23±0.311)2)0.28±0.031)2)0.45±0.051)2)0.87±0.071)2)0.83±0.091)2)0.36±0.051)2)F值P值44.1640.00010.2600.00123.7390.00019.3980.00034.1420.000102.6530.000

2.3沉默SLCO4A1-AS1對宮頸癌細(xì)胞HeLa遷移和侵襲的影響 與NC組和si-con組比較，si-SLCO4A1-AS1組HeLa細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)均顯著降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目均顯著較少(P<0.05)。見圖2、表3。提示沉默SLCO4A1-AS1抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

圖2 宮頸癌細(xì)胞HeLa遷移和侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)(結(jié)晶紫染色，×200)

組別遷移細(xì)胞數(shù)目(個(gè))侵襲細(xì)胞數(shù)目(個(gè))MMP-2MMP-9NC組176.37±15.2185.73±9.480.83±0.090.64±0.05si-con組172.86±12.3891.33±9.560.88±0.080.69±0.07si-SLCO4A1-AS1組75.46±8.461)2)25.28±4.561)2)0.46±0.051)2)0.31±0.041)2)F值194.153179.24083.594127.900P值0.0000.0000.0000.000

2.4SLCO4A1-AS1靶向調(diào)控miR-876-3p的表達(dá) 生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SLCO4A1-AS1和miR-876-3p存在部分連續(xù)特異性互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖3。miR-876-3p組SLCO4A1-AS1-WT水平顯著低于miR-con組(P<0.001),見表4。si-con組HeLa細(xì)胞miR-876-3p的表達(dá)水平(1.00±0.09)顯著低于si-SLCO4A1-AS1組(4.36±0.44，P<0.05)；pcDNA組HeLa細(xì)胞miR-876-3p的表達(dá)水平(0.96±0.08)顯著高于pcDNA-SLC04A1-AS1組(0.53±0.05，P<0.05)。提示miR-876-3p是SLCO4A1-AS1的靶基因，SLCO4A1-AS1能夠靶向負(fù)調(diào)控miR-876-3p的表達(dá)。

圖3 SLCO4A1-AS1與miR-876-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5過表達(dá)miR-876-3p對宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖、遷移、侵襲的影響 與NC組和miR-con組比較，miR-876-3p組HeLa細(xì)胞miR-876-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，表明過表達(dá)miR-876-3p的宮頸癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。與NC組和miR-con組比較，miR-876-3p組HeLa細(xì)胞p21蛋白的表達(dá)水平顯著升高，CyclinD1、MMP-9、MMP-2蛋白的表達(dá)水平顯著下降，細(xì)胞增殖活力顯著降低，遷移和侵襲數(shù)目顯著減少(均P<0.05)，見圖4、表5。提示過表達(dá)miR-876-3p抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

圖4 過表達(dá)miR-876-3p對宮頸癌細(xì)胞HeLa中p21、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

組別CyclinD1MMP-9MMP-2遷移細(xì)胞數(shù)目(個(gè))侵襲細(xì)胞數(shù)目(個(gè))NC組0.84±0.080.92±0.090.84±0.08180.92±15.5781.64±7.84miR-con組0.81±0.080.94±0.070.78±0.09176.84±15.6778.68±8.52miR-876-3p組0.42±0.041)2)0.51±0.061)2)0.47±0.051)2)72.63±7.681)2)32.35±4.761)2)F值102.93895.80162.629185.964131.650P值0.0000.0000.0000.0000.000

2.6抑制miR-876-3p部分逆轉(zhuǎn)沉默SLCO4A1-AS1對宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖、遷移、侵襲的作用 與si-con組比較，si-SLCO4A1-AS1組HeLa細(xì)胞miR-876-3p和p21表達(dá)顯著升高，CyclinD1、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著下降，細(xì)胞增殖活力顯著降低，遷移和侵襲數(shù)目顯著減少(均P<0.05)；與si-SLCO4A1-AS1+anti-miR-con組比較，si-SLCO4A1-AS1+anti-miR-876-3p組HeLa細(xì)胞miR-876-3p和p21表達(dá)顯著降低，CyclinD1、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞增殖活力顯著升高，遷移和侵襲數(shù)目顯著增加(P<0.05)，見圖5、表6。提示抑制miR-876-3p表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)沉默SLCO4A1-AS1對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響。

1～4：si-con組、si-SLCO4A1-AS1組、si-SLCO4A1-AS1+anti-miR-con組、si-SLCO4A1-AS1+ anti-miR-876-3p組圖5 抑制miR-876-3p對宮頸癌細(xì)胞HeLa中p21、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

宮頸癌是全球最嚴(yán)重的女性惡性腫瘤之一，轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者的生存率較低〔3〕。研究表明，LncRNA在宮頸癌中發(fā)揮細(xì)胞調(diào)節(jié)因子作用，參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展〔7〕。

SLCO4A1-AS1定位于人類20q13.33位點(diǎn)，是一種新型的LncRNA。研究顯示，SLCO4A1-AS1在惡性腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Wang等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，SLCO4A1-AS1在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，SLCO4A1-AS1通過調(diào)控miR-508-3p/分離缺陷基因(PARD)3軸誘導(dǎo)保護(hù)性自噬促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖；Yang等〔9〕指出在膀胱癌組織中SLCO4A1-AS1也呈高表達(dá)，SLCO4A1-AS1的表達(dá)水平與膀胱癌晚期和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，SLCO4A1-AS1表達(dá)上調(diào)提示膀胱癌患者預(yù)后不良，沉默SLCO4A1-AS1可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，抑制腫瘤在體內(nèi)的生長；此外，Yang等〔6〕研究表明，SLCO4A1-AS1還可通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)結(jié)腸癌腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明，SLCO4A1-AS1在宮頸癌中可能發(fā)揮致癌基因作用。

許多研究報(bào)道LncRNA可阻斷miRNA在腫瘤進(jìn)展中的功能，恢復(fù)靶基因的表達(dá)，參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。Shao等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA STXBP5-AS1通過靶向miR-96-5p/PTEN軸抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力；Jin等〔11〕認(rèn)為，LncRNA小核仁RNA宿主基因(SNHG)12可抑制miR-125b活性，促進(jìn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)3在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的形成。然而SLCO4A1-AS1能否通過類似的機(jī)制調(diào)控宮頸癌的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。生物信息學(xué)分析顯示，SLCO4A1-AS1可能在宮頸癌中與miR-876-3p直接相互作用。miR-876-3p位于人9號染色體p21.1位點(diǎn)，研究顯示，miR-876-3p在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)下調(diào)，可能與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的耐藥有關(guān)〔12〕；在胃癌細(xì)胞中miR-876-3p呈低表達(dá)，其表達(dá)下調(diào)與胃癌患者不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，過表達(dá)miR-876-3p靶向p24跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TMED)3可增加胃癌順鉑耐藥細(xì)胞的藥物敏感性〔13〕。本研究結(jié)果表明，SLCO4A1-AS1可能直接靶向miR-876-3p參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果提示，SLCO4A1-AS1通過靶向miR-876-3p促進(jìn)宮頸癌的惡性進(jìn)展。已有的研究表明，STAT3在宮頸癌中顯著上調(diào)，抑制STAT3進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔14，15〕。環(huán)狀RNA-0006988通過調(diào)控miR-876-3p/STAT3促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔16〕。在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步探究SLCO4A1-AS1調(diào)控miR-876-3p/STAT3通路在宮頸癌進(jìn)展中的作用。

綜上，SLCO4A1-AS1在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，miR-876-3p表達(dá)下調(diào)。沉默SLCO4A1-AS1通過靶向miR-876-3p抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。SLCO4A1-AS1有望成為一種新型的宮頸癌治療靶點(diǎn)。