孫傲，焦寒，付杰軍

0 引言

熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（heat shock transcription factor 1,HSF1）是調(diào)控?zé)嵝菘说鞍祝╤eat-shock proteins,HSPs）表達的轉(zhuǎn)錄因子。細胞未受刺激時，HSF1以單體形式在細胞核和細胞質(zhì)之間穿梭，當細胞受到刺激時，游離的HSF1以三聚體的形式磷酸化，并入核誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄[1]，在熱激過程中Ser326位點的HSF1磷酸化可以正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄。在此期間，HSF1與錯誤折疊的蛋白質(zhì)被蛋白酶體降解，并延遲熱休克反應(yīng)的衰減直到清除受損的蛋白質(zhì)為止[2]。

FBXW7（F-box and WD repeat domain containing 7）是F-box家族的重要成員之一，為SCF（SKP1-Cullin1-F-box）E3泛素連接酶復(fù)合物的靶蛋白識別組分[3]。FBXW7是繼K-RAS和APC之后研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中最常見的突變基因之一[4]。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中FBXW7的表達水平低于正常組織，其失活會誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生[5]。約7.5%的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸腺癌患者中發(fā)現(xiàn)FBXW7錯義突變，與結(jié)直腸癌不良預(yù)后有關(guān)[6]。FBXW7介導(dǎo)多種癌蛋白的降解，如NF-κB、c-Myc、Cyclin E、Notch1、c-Jun和Brg1等[7]。FBXW7位于人4號染色體長臂（4q31.3）上，分為FBXW7α、FBXW7β和FBXW7γ三個亞型，其中FBXW7α位于細胞核中，F(xiàn)BXW7β位于細胞質(zhì)中，而FBXW7γ位于核仁中[8]。FBXW7α通過與GSK3β激活的Ser303和Ser307位點磷酸化HSF1結(jié)合，介導(dǎo)HSF1泛素化降解。有研究發(fā)現(xiàn)缺失FBXW7α導(dǎo)致黑色素瘤細胞核HSF1蛋白表達水平明顯升高，而對細胞質(zhì)HSF1表達沒有影響[9]。然而，F(xiàn)BXW7對結(jié)直腸癌細胞胞質(zhì)和胞核內(nèi)的HSF1在熱刺激后及未刺激狀態(tài)下的表達定位的調(diào)控尚不清楚。本研究利用細胞免疫熒光法觀察敲除FBXW7對溫?zé)岽碳ぜ盎謴?fù)期間HSF1在胞質(zhì)和胞核中的定位的影響，明確FBXW7在HSF1及激活的HSF1在胞核中的表達定位的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株及試劑

人結(jié)直腸癌細胞系HCT116、DLD1 及HCT116 WT、HCT116 FBXW7 KO、DLD1 WT及DLD1 FBXW7 KO、真核表達質(zhì)粒PcDNA3-HAFBXW7α[10]均由美國哈佛醫(yī)學(xué)院貝斯以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心病理系魏文毅教授饋贈。FBXW7基因敲除的HCT116和DLD1細胞由Bert Vogelstein和Christoph Lengauer構(gòu)建，得到Bert Vogelstein的饋贈[11]。主要通過利用細菌人工染色體（BAC）系統(tǒng)進行基因克隆，并通過Cre/loxP敲除系統(tǒng)和單克隆細胞篩選獲得FBXW7基因敲除的HCT116和DLD1細胞[12]。結(jié)直腸癌細胞均用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM減血清培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，BCA試劑盒（貨號P0011）及蛋白質(zhì)提取相關(guān)試劑均購自上海碧云天公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000（貨號L3000075）購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的結(jié)直腸癌細胞株DLD1接種于6個60 mm的培養(yǎng)皿中，接種密度以過夜培養(yǎng)后細胞融合度為70%～90%為準。按照Lipofectamine3000說明書提供的操作流程，以O(shè)pti-MEM減血清培養(yǎng)基配制轉(zhuǎn)染試劑及質(zhì)粒工作液，將PcDNA3-HA-FBXW7α真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入DLD1細胞中。轉(zhuǎn)染6 h后更換含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 Western blot法檢測過表達FBXW7α基因?qū)SF1蛋白表達水平的影響

收集轉(zhuǎn)染24 h后的DLD1細胞，加入細胞裂解液RIPA提取細胞總蛋白，用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度，通過10%SDS-PAGE分離蛋白，采用90V電壓將分離蛋白條帶轉(zhuǎn)移到活化的PVDF膜。用含5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉膜1.5 h，然后加入兔抗人HSF1（CST，貨號4356，1:1000）、兔抗人pHSF1Ser326單克隆抗體（Invitrogen，貨號MA5-32105，1:1000）及鼠抗人β-actin（CST，貨號3700，1:1000）、HA（Sigma，貨號H9658，1:1000）單克隆抗體4℃孵育過夜；加入HRP標記的羊抗鼠IgG（CST，貨號7076，1:5000）及羊抗兔 IgG（CST，貨號7074，1:5000）。滴加化學(xué)發(fā)光HRP底物ECL發(fā)光液（Millipore，貨號WBKLS0500），使用MiniChemi 610Plus型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行曝光顯影。實驗重復(fù)3次。

1.4 Western blot法檢測FBXW7對結(jié)直腸癌細胞中HSF1蛋白表達的影響

收集HCT116WT、HCT116 FBXW7 KO、DLD1 WT及DLD1 FBXW7 KO細胞,加入細胞裂解液RIPA提取細胞總蛋白，取對數(shù)生長期細胞進行42℃水浴溫?zé)岽碳? h，并在37℃培養(yǎng)恢復(fù)30 min和60 min，用核蛋白提取試劑盒提取細胞核蛋白和胞質(zhì)蛋白。用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度，通過10%SDS-PAGE分離蛋白，采用90V電壓將分離蛋白條帶轉(zhuǎn)移到活化的PVDF膜。用含5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉膜1.5 h，然后加入兔抗人HSF1（CST，貨號4356，1:1000）、兔抗人pHSF-1Ser326單克隆抗體（Invitrogen，貨號MA5-32105，1:1000）及鼠抗人β-actin（CST，貨號3700，1:1000）、Lamin A/C（CST，貨號4777，1:1000）單克隆抗體4℃孵育過夜；加入HRP標記的羊抗鼠IgG（CST，貨號7076，1:5000）及羊抗兔IgG（CST，貨號7074，1:5000），滴加化學(xué)發(fā)光HRP底物ECL發(fā)光液（Millipore，貨號WBKLS0500），使用MiniChemi 610Plus型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行曝光顯影。實驗重復(fù)3次。

1.5 細胞免疫熒光法檢測FBXW7對激活的HSF1在結(jié)直腸癌細胞中表達定位的影響

取對數(shù)生長期的HCT116 WT、HCT116 FBXW7 KO、DLD1 WT及DLD1 FBXW7 KO細胞，制備細胞爬片。待細胞融合度達90%時，進行42℃水浴溫?zé)岽碳? h，并在37℃培養(yǎng)恢復(fù)30 min和60 min，用4%多聚甲醛溶液室溫固定20 min；用0.3%Triton X-100室溫通透20 min；3%BSA室溫封閉1 h；加入兔抗人HSF1（CST，貨號4356，1:200）和pHSF1Ser326單克隆抗體（Invitrogen，貨號MA5-32105，1:200）4℃過夜；加入Alexa Fluor 488標記（Invitrogen，貨號A-11008，1:400）及Alexa Fluor 555標記（Invitrogen，貨號A-21428，1:400）的羊抗兔IgG，避光反應(yīng)2 h；加入DAPI熒光封片劑對細胞核進行染色及封片，熒光顯微鏡（日本奧林巴斯BX53）觀察HSF1的表達位置變化。實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有實驗獨立重復(fù)3次，結(jié)果數(shù)據(jù)以（）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FBXW7α 基因過表達結(jié)直腸癌細胞中pHSF1Ser326蛋白的表達水平

與對照組相比，DLD1細胞轉(zhuǎn)染PcDNA3-HA-FBXW7α真核表達質(zhì)粒后，pHSF1Ser326蛋白的表達水平顯著降低（P=0.0003），見圖1。提示FBXW7α可以靶向下調(diào)HSF1的蛋白表達水平。

圖1 轉(zhuǎn)染后DLD1細胞中pHSF1Ser326蛋白的表達 (n=3)Figure 1 Expressions of pHSF1Ser326 protein decreased in DLD1 cells after transfection (n=3)

2.2 缺失FBXW7對HSF1和pHSF1Ser326蛋白在胞質(zhì)和胞核表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，DLD1 FBXW7 KO細胞的HSF1總蛋白的表達水平高于DLD1 WT細胞（P=0.029），HCT116 FBXW7 KO細胞的HSF1總蛋白的表達水平高于HCT116 WT細胞（P=0.039）；HCT116 FBXW7 KO細胞中pHSF1Ser326總蛋白的表達水平顯著高于HCT116 WT細胞（P=0.019），見圖2A。進一步采用細胞免疫熒光法觀察到FBXW7 KO細胞中HSF1和pHSF1Ser326主要聚集在胞核，在胞質(zhì)中僅有少量表達。結(jié)果表明，F(xiàn)BXW7的缺失導(dǎo)致HSF1和pHSF1Ser326總蛋白表達水平顯著升高，并且主要在胞核中表達，見圖2B～C。

圖2 FBXW7的缺失導(dǎo)致結(jié)直腸癌細胞中HSF1和pHSF1Ser326主要在胞核中累積Figure 2 Loss of FBXW7 resulted in accumulation of HSF1 and pHSF1Ser326 mainly in nucleus of CRC cells

2.3 缺失FBXW7對溫?zé)岽碳ず驢SF1在胞核中累積時間的影響

對結(jié)直腸癌細胞42℃溫?zé)岽碳こ掷m(xù)1 h，并在37℃培養(yǎng)指定時間。細胞免疫熒光法檢測結(jié)果顯示，溫?zé)岽碳ぜ毎驢SF1在細胞核中表達迅速增強，恢復(fù)30 min后，HCT116 WT和DLD1 WT細胞中的核HSF1表達逐漸恢復(fù)至未刺激水平，F(xiàn)BXW7 KO的兩種細胞中HSF1在核中表達較強，恢復(fù)60 min后仍然可以看到在核中表達較強，見圖3。表明FBXW7的缺失導(dǎo)致溫?zé)岽碳ぜ毎驢SF1恢復(fù)至未刺激水平的時間延長。

圖3 FBXW7的缺失使溫?zé)岽碳ぜ毎驢SF1在胞核中累積時間延長Figure 3 Loss of FBXW7 prolonged accumulation of HSF1 in nucleus after warm stimulation

2.4 FBXW7調(diào)控激活的HSF1在胞質(zhì)和胞核中的表達定位

對結(jié)直腸癌細胞分別進行42℃溫?zé)岽碳こ掷m(xù)1 h，并在37℃恢復(fù)指定時間。Western blot結(jié)果顯示，溫?zé)岽碳ず?7℃恢復(fù)培養(yǎng)60 min組（Recovery 60 min組）和37℃培養(yǎng)對照組（Untreated組）的DLD1 WT細胞中的pHSF1Ser326蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.305），即恢復(fù)60 min后DLD1 WT細胞逐漸恢復(fù)至未刺激水平。與Untreated組相比，Recovery 60 min組的DLD1細胞的FBXW7 KO細胞核中pHSF1Ser326蛋白表達水平明顯上調(diào)（P=0.007），HCT116細胞的FBXW7 KO細胞核中pHSF1Ser326蛋白表達水平也顯著上調(diào)（P=0.002），見圖4A～B。細胞免疫熒光結(jié)果顯示，溫?zé)岽碳ず驠BXW7 KO細胞中的pHSF1Ser326在細胞核中表達均高于WT細胞，37℃培養(yǎng)60 min后，HCT116 WT和DLD1 WT細胞恢復(fù)至未刺激水平，F(xiàn)BXW7 KO細胞中的pHSF1Ser326在胞核中表達仍然很強，在胞質(zhì)中表達較弱，見圖4C～D。以上結(jié)果表明，熱激后HSF1表達水平恢復(fù)受阻可能與缺失FBXW7不能降解核HSF1有關(guān)，F(xiàn)BXW7可能調(diào)控激活及衰減期間的HSF1在胞質(zhì)和胞核中的表達定位。

圖4 FBXW7調(diào)控激活的HSF1在胞質(zhì)和胞核中的表達定位Figure 4 FBXW7 regulated the expression and the localization of activate HSF1 in cytoplasm and nucleus.

3 討論

熱休克反應(yīng)（heat shock response,HSR）是一種細胞保護機制，可防止由于溫?zé)岽碳?、缺氧、細胞?nèi)pH值波動或暴露于重金屬等的刺激引起的蛋白質(zhì)錯誤折疊。HSR由轉(zhuǎn)錄因子HSF1誘導(dǎo)熱休克蛋白的動態(tài)轉(zhuǎn)錄過程。在未受刺激的細胞中，HSF1處于失活狀態(tài)；當受到應(yīng)激刺激時，HSF1在細胞核中被磷酸化，形成同源三聚體，結(jié)合DNA并激活熱休克基因轉(zhuǎn)錄[1]。HSF1的激活和恢復(fù)期間受到多種翻譯后修飾的調(diào)節(jié)，尤其是磷酸化對HSF1調(diào)控轉(zhuǎn)錄具有重要作用。Ser121、Ser303、Ser307以及Ser363磷酸化負調(diào)控HSF1的轉(zhuǎn)錄活性，而mTOR、MEK和P38 MAPK可以催化Ser326的磷酸化從而激活HSF1[13]。基質(zhì)中磷酸化HSF1的激活與卵巢癌、慢性淋巴細胞性白血病和骨髓瘤患者的預(yù)后不良有關(guān)[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，細胞核中HSF1的表達水平增高與結(jié)直腸癌、乳腺癌、腎癌和口腔鱗狀細胞癌的轉(zhuǎn)移和不良的生存率有關(guān)[15]。因此，深入研究激活后的HSF1在細胞核中的表達水平及定位對腫瘤的治療具有重要意義。

既往研究表明，F(xiàn)BXW7對HSF1的泛素化和降解與腫瘤細胞耐藥有關(guān)[16]。在胃癌中，細胞核中的代謝酶PDK3以破壞HSF1磷酸化的方式阻止FBXW7介導(dǎo)的HSF1蛋白酶體降解，PDK3與HSF1相互作用形成正反饋回路以促進糖酵解[17]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2在耐藥細胞中可降低FBXW7的表達，并且通過抑制HSF1的泛素化降解導(dǎo)致MDR1的轉(zhuǎn)錄激活[18]。FBXW7參與HSF1靶向腸缺血再灌注期間的泛素化和降解，表明FBXW7可能是抑制腸缺血再灌注期間腸黏膜凋亡的潛在治療靶標[19]。Nikos等[9]發(fā)現(xiàn)HSF1可以與FBXW7α結(jié)合，是FBXW7α的泛素化底物，通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)缺失FBXW7的結(jié)直腸癌細胞HCT116在基礎(chǔ)狀態(tài)下，核HSF1蛋白的表達水平增高，胞質(zhì)HSF1蛋白表達無變化；而溫?zé)岽碳ず蟮腍SF1蛋白在核中表達水平顯著增高，且熱休克反應(yīng)時間延長；他們還發(fā)現(xiàn)缺失FBXW7導(dǎo)致黑色素瘤細胞WM39的核HSF1表達水平明顯升高，而對細胞質(zhì)HSF1表達無影響，溫?zé)岽碳ず蠛薍SF1蛋白表達水平增強，恢復(fù)期間缺失FBXW7的WM39細胞中的HSF1在核中累積[9]。HSF1在胞核中的累積是由于HSF1在胞質(zhì)和胞核中的動態(tài)轉(zhuǎn)移變化，還是溫?zé)岽碳rFBXW7不調(diào)控HSF1的降解，導(dǎo)致HSF1在核中累積，還尚不清楚。

本研究采用細胞免疫熒光法對敲除FBXW7的結(jié)直腸癌細胞進行42℃溫?zé)岽碳げ⒂^察HSF1的表達定位，此細胞免疫熒光HSF1的定位結(jié)果與文獻[9]所報道的缺失FBXW7導(dǎo)致HSF1蛋白在核中累積的Western blot結(jié)果一致。為進一步探討FBXW7是否調(diào)節(jié)激活的HSF1在胞核中的表達和定位，通過細胞免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，敲除FBXW7的細胞溫?zé)岽碳げ⒒謴?fù)37℃培養(yǎng)30 min后，pHSF1Ser326在胞核中的表達仍較強，表明缺失FBXW7導(dǎo)致細胞核中的HSF1降解受阻。有研究表明，HSF1基礎(chǔ)表達主要在細胞核內(nèi)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，Western blot實驗表明HSF1在胞質(zhì)有較強的表達，而免疫熒光實驗卻顯示HSF1主要定位在細胞核。這可能是由于分離細胞核和細胞質(zhì)所用的裂解液造成的，大多數(shù)以單體形式存在的HSF1可能在裂解作用下從細胞核中提取出來，而三聚體的HSF1在提取過程中仍與細胞核DNA緊密結(jié)合[20]。

綜上所述，本研究證實了FBXW7可調(diào)控HSF1及激活的磷酸化HSF1在胞質(zhì)和胞核中的表達和定位。推測FBXW7可能成為結(jié)直腸癌治療的潛在分子調(diào)控靶點。