吳敏超，李 璇，段偉娜，張海峰＊

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059）

20世紀(jì)80年代末日本學(xué)者Hiroko Iwama提出的“血清藥理學(xué)方法”被認(rèn)為是中藥研究的新突破?！昂幯濉笔侵付〞r(shí)定量給動物服用藥物之后，經(jīng)過一定時(shí)間后采血，離心后得到的血清。與其他方法相比，含藥血清可以較好地反映復(fù)合藥物的有效作用成分及作用環(huán)境。含藥血清因其獨(dú)特的優(yōu)勢，而被眾多科研人員所采用，并進(jìn)行了深入的探索與研究[1，2]。氧化應(yīng)激是由于抗氧化劑系統(tǒng)和活性氧（ROS）生產(chǎn)速率不平衡所引起的。適量水平的ROS在正常細(xì)胞生理中很重要，但是過量ROS引起的氧化應(yīng)激超出生理需要可能會干擾正常過程[3~5]。氧化應(yīng)激是多種肝損傷發(fā)病的重要機(jī)制，氧化應(yīng)激參與炎癥、代謝和纖維化性肝病的過程，并與病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、肝纖維化、肝癌所致的肝損傷密切相關(guān)[6]。古日古木-13是一種蒙藥傳統(tǒng)方劑。由紅花、木香、梔子、麝香、麥冬、川楝子、牛黃、訶子、銀朱、紫檀香、水牛角、丁香及蓮子等十三味藥材配制而成。目前，蒙醫(yī)領(lǐng)域已經(jīng)廣泛應(yīng)用古日古木-13[7]。鄔國棟、郭葉等人曾采用HPLC法，以梔子苷為內(nèi)參物，建立沒食子酸、羥基紅花黃色素A、鞣花酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的相對校正因子，計(jì)算古日古木-13樣品中該6種成分的含量[8]，但卻未曾有人檢測蒙藥古日古木-13含藥血清的有效成分，本研究選用過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)Huh-7肝癌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，研究蒙藥古日古木-13的抗氧化作用及其保護(hù)機(jī)制，為深入研究其在多種肝病治療上的應(yīng)用提供重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動物及主要藥品

本研究選用實(shí)驗(yàn)動物為250g的健康SD大鼠SCXK（蒙）2016-0001，雄性，SPF級，購于內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心。Huh-7人肝癌細(xì)胞購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。蒙藥古日古木-13（水丸）內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司，硫普羅寧腸溶片上海凱寶新宜藥業(yè)有限公司，3%過氧化氫試劑Sigma。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 H2O2致肝癌細(xì)胞損傷模型的建立

取對數(shù)生長期細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)約為1×104，均勻細(xì)胞懸液至96孔板，于培養(yǎng)箱孵育24 h；加H2O2培養(yǎng)1 h。加10μL CCK8試劑，于培養(yǎng)箱孵育90 min，測其OD值，計(jì)算細(xì)胞抑制率及IC50（半數(shù)抑制率）[9，10]。

2.2 蒙藥古日古木-13含藥血清及含藥血清培養(yǎng)基的制備

將SD大鼠40只，分為蒙藥高、中、低劑量組、PBS組（PBS＋1%土溫80）。適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后灌胃，灌胃前12 h禁食。連續(xù)灌胃7天，于最后一次灌胃后1 h心臟取血。離心，濾器過濾，56℃滅活。含藥血清、雙抗、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基按1：0.1：9比例配置完全培養(yǎng)基。4℃冰箱保存。

2.3 蒙藥古日古木-13含藥血清最適濃度的選取

將細(xì)胞分為空白血清組、H2O2＋空白血清組、H2O2＋陽性血清組、H2O2＋古13血清組，均勻接種96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育過夜；棄去原培養(yǎng)液，加入100μL含藥血清培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育6h、12h、18h、24h。加H2O2，培養(yǎng)箱孵育1 h。加10μL CCK8試劑，于培養(yǎng)箱孵育90 min，測其OD值。計(jì)算細(xì)胞增殖率，選取最適濃度組。

2.4 HPLC法檢測血清中有效成分含量

如上述2.2步驟制備含藥血清，3000 r/min，離心15 min，吸取血清。取100μL血清加入300μL色譜甲醇，混勻后12000 r/min離心3 min，吸取上清，參考鄔國棟、郭葉等人研究[8]，采用HPLC法，計(jì)算古日古木-13樣品中有效成分。

2.5 Huh-7細(xì)胞凋亡率

接種對數(shù)生長期的Huh-7細(xì)胞于6孔板。培養(yǎng)箱孵育至貼壁生長；棄去培養(yǎng)液，加入含藥血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育18 h。加H2O2培養(yǎng)1 h。吸取6孔板內(nèi)上清，加到6個離心管內(nèi)（終止胰酶作用），PBS沖洗6孔板3次，加入胰酶消化2 min，收集6孔板內(nèi)細(xì)胞，標(biāo)號按順序加入之前的6個離心管內(nèi)，離心，棄上清。加入200μL結(jié)合液，吹打重懸細(xì)胞，加入5μL FITC染液，5μL PI染液，輕輕混勻。避光孵育10~20 min，室溫放置，等待上機(jī)檢測。其間每管又加300μL結(jié)合液，過400目細(xì)胞篩于流式上樣管中。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

2.6 qPCR法檢測NF-κB的表達(dá)水平

種對數(shù)生長期的Huh-7細(xì)胞于6孔板，培養(yǎng)箱孵育至貼壁生長；棄去培養(yǎng)液，加入含藥血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育18 h。加過氧化氫，孵育1 h后，用Trizol提取總RNA。

表2 引物序列

2.7 細(xì)胞總蛋白提取及蛋白印跡法測蛋白表達(dá)量

種對數(shù)生長期的Huh-7細(xì)胞于6孔板，培養(yǎng)箱孵育至貼壁生長；棄去培養(yǎng)液，加入含藥血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育18 h。加入H2O2，37℃，5%CO2，孵育1 h。棄去培養(yǎng)液，用冷PBS沖洗2遍，加入100μL預(yù)冷含PMSF的蛋白質(zhì)裂解液，離心取上清，加上樣緩沖液，將蛋白放入沸水中煮10 min。加樣、電泳、恒流轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉1 h后，放入一抗盒中孵育，4℃過夜。TBST沖洗10 min，重復(fù)3遍。常溫孵育二抗1 h。TBST洗膜3次。顯色。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用Graphpad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)資料采用表示，兩兩比較采用取LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度H2O2損傷Huh-7細(xì)胞后細(xì)胞存活率的變化

通過CCK8法及IC50公式可知，肝細(xì)胞生存率隨著H2O2濃度升高而降低（見圖1）。Huh-7細(xì)胞半數(shù)致死率為930 mmol/mL。H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型制備成功。

3.2 不同濃度含藥血清對H2O2損傷Huh-7細(xì)胞的保護(hù)作用

不同濃度的古13含藥血清對H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型均有作用，其中中劑量濃度古13含藥血清，效果最明顯（P<0.05），作為后續(xù)作用條件。古13含藥血清孵育人Huh-7細(xì)胞6 h、12 h及24 h的保護(hù)作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。孵育18 h后，中劑量古13含藥血清對H2O2誘導(dǎo)人Huh-7細(xì)胞損傷有顯著的保護(hù)作用（P＜0.05）（見圖2）。

圖1 不同濃度H2O2損傷Huh-7細(xì)胞后細(xì)胞存活率的變化

3.3 液相色譜分析圖分析

通過分析液相色譜分析圖（見圖3~6），含藥血清主要成分是沒食子酸及鞣花酸。

圖2 不同濃度含藥血清對H2O2損傷Huh-7細(xì)胞的保護(hù)作用

圖3 沒食子酸一級結(jié)構(gòu)

圖5 鞣花酸酸一級結(jié)構(gòu)

圖6 鞣花酸二級碎片

為沒食子酸（C7H6O5）標(biāo)準(zhǔn)品及蒙藥含藥血清待測品，tR/MIN為3.27，其[M-H]-為169.01314，二級碎片為109.06577（見圖3）；為鞣花酸（C14H6O8）標(biāo)準(zhǔn)品及蒙藥含藥血清待測品，tR/MIN為11.82，其[M-H]-為300.99789，二級碎片為245.0307（見圖5）。由此可知蒙藥含藥血清主要成分是沒食子酸及鞣花酸，其中以鞣花酸為主。

3.4 H2O2損傷的Huh-7細(xì)胞后凋亡率變化

通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，H2O2誘導(dǎo)Huh-7肝細(xì)胞損傷模型成功，即H2O2＋10%空白血清組作用的肝細(xì)胞凋亡率（62.50%±1.322%）高于10%空白血清組作用的肝細(xì)胞凋亡率（6.443%±1.075%）（P＜0.05），H2O2＋10%古13血清組作用的Huh-7肝細(xì)胞凋亡率（53.36%±0.7428%）小于H2O2＋10%空白血清組作用的肝細(xì)胞凋亡率（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖7）。

圖7 H2O2損傷的Huh-7細(xì)胞后凋亡率變化

通過熒光定量PCR技術(shù)，各血清組分別作用Huh-7細(xì)胞18 h，與10%空白血清組NF-κB mRNA相比，H2O2＋10%空白血清組NF-κB mRNA表達(dá)量升高，表明造模成功；與H2O2＋10%空白血清組NF-κB mRNA表達(dá)量相比，H2O2＋10%陽性血清組及H2O2＋10%古13血清組表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）（見圖8）。

圖8 H2O2損傷的Huh-7細(xì)胞NF-κB表達(dá)量的變化

3.6 H2O2損傷的Huh-7細(xì)胞的NF-κB蛋白表達(dá)變化統(tǒng)計(jì)

通過蛋白質(zhì)印跡法檢測NF-κB蛋白表達(dá)量，Image J軟件分析目的蛋白顯影灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值，可得出如下結(jié)論（見圖9）：各血清組分別作用Huh-7細(xì)胞18 h，與10%空白血清組NF-κB蛋白相比，H2O2＋10%空白血清組NF-κB蛋白表達(dá)量升高，證明造模成功；與H2O2＋10%空白血清組NF-κB蛋白表達(dá)量相比，H2O2＋10%陽性血清組蛋白表達(dá)量及H2O2＋10%古13血清組蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。

圖9 H2O2損傷的Huh-7細(xì)胞的NF-κB蛋白表達(dá)變化統(tǒng)計(jì)圖

4 討論

蒙藥古日古木-13已廣泛應(yīng)用于肝臟疾病的治療，還可與其他蒙藥聯(lián)合應(yīng)用治療多種疾病[11~13]。經(jīng)本課題組前期研究證明，蒙藥古日古木-13對小鼠肝部分切除術(shù)誘導(dǎo)的肝損傷有明顯的保護(hù)作用。但其是否對氧化應(yīng)激損傷的肝細(xì)胞有保護(hù)作用，鮮有報(bào)道，為此本課題設(shè)計(jì)了該實(shí)驗(yàn)。本文選取不同濃度的H2O2作用于人Huh-7細(xì)胞，造成細(xì)胞損傷，使細(xì)胞活性降低，通過CCK-8試劑檢測人Huh-7細(xì)胞在H2O2不同濃度損傷的作用下，細(xì)胞存活率。通過IC50公式計(jì)算細(xì)胞半抑制率，結(jié)果顯示當(dāng)Huh-7細(xì)胞抑制率為50%時(shí)，H2O2的濃度為930 μmol/L時(shí)。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采取此濃度建立細(xì)胞損傷模型。

鄔國棟、郭葉等人曾采用HPLC法，檢測出古日古木-13樣品中6種成分的含量，未有報(bào)道顯示檢測蒙藥古日古木-13含藥血清有效成分，本課題組，通過HPLC法，以梔子苷為內(nèi)參物，檢測到蒙藥古日古木-13含藥血清的有效成分是沒食子酸及鞣花酸。其中鞣花酸占比較高。鞣花酸是一種天然多酚類植物化學(xué)物的衍生物，具有抗氧化、抗癌、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗菌和抗毒性等作用[14]。文獻(xiàn)證明，鞣花酸所含的羥基能明顯增強(qiáng)其抗氧化損傷的能力，在口服吸收后0.5~1.0h內(nèi)血清中鞣花酸濃度達(dá)到峰值[15]。蒙藥古日古木-13含藥血清含有大量鞣花酸，因此蒙藥古日古木-13含藥血清對過氧化氫誘導(dǎo)人Huh-7細(xì)胞有明顯保護(hù)作用。

為實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究蒙藥古日古木-13含藥血清對過氧化氫誘導(dǎo)人Huh-7細(xì)胞的保護(hù)作用。將大鼠隨機(jī)分為PBS空白組、古日古木-13低、中、高劑量組，灌胃7天，于末次灌胃后1 h心臟取血。制備蒙藥古日古木-13含藥血清。通過CCK-8試劑檢測不同濃度的蒙藥古日古木-13含藥血清提前6 h、12 h、18 h、24 h加入細(xì)胞培養(yǎng)基中作用Huh-7細(xì)胞，細(xì)胞存活率，分析蒙藥古日古木-13含藥血清作用的最佳時(shí)間及最佳濃度。結(jié)果顯示，當(dāng)提前18 h加入蒙藥古日古木-13中劑量含藥血清培養(yǎng)基時(shí)，其保護(hù)作用最佳。

細(xì)胞凋亡是有核細(xì)胞通過啟動自身內(nèi)部的遺傳機(jī)制激活內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶而發(fā)生的一種主動細(xì)胞死亡過程。通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，蒙藥古日古木-13含藥血清作用過氧化氫損傷的Huh-7細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率明顯下降。

氧化應(yīng)激損傷是最常見的應(yīng)激損傷，是細(xì)胞中ROS水平超過細(xì)胞抗氧化能力的一種狀態(tài)，也是肝損傷發(fā)生機(jī)制中的重要損傷機(jī)制和環(huán)節(jié)。氧化應(yīng)激反應(yīng)常引起NF-κB信號通路表達(dá)。NF-κB是一種多效性的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控多種基因的表達(dá)，這些基因也可促進(jìn)各種腫瘤細(xì)胞的生長、存活和轉(zhuǎn)化。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子是中央?yún)f(xié)調(diào)宿主防御者對壓力，傷害和感染的反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。本課題通過逆轉(zhuǎn)錄酶定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）實(shí)驗(yàn)可知，蒙藥古日古木-13含藥血清中劑量組NF-κB表達(dá)量較模型組NF-κB表達(dá)量明顯下降（P＜0.05）。說明古13含藥血清中劑量組對過氧化氫誘導(dǎo)人Huh-7細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與NF-κB通路有關(guān)。