張玉婕， 朱靜華， 王祖祿， 閆承慧， 韓雅玲

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽110016；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847

心血管并發(fā)癥是世界范圍內(nèi)死亡的主要原因，大多心血管并發(fā)癥的潛在病理生理學(xué)是動脈粥樣硬化[1]，特征為大中型血管中形成富含脂質(zhì)的斑塊，動脈粥樣硬化是動脈壁的一種慢性炎癥性疾病[2]。紅花為菊科植物紅花的干燥花，性溫，味辛，歸心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛之功效，用于治療經(jīng)閉、痛經(jīng)、惡露不行、癥瘕痞塊、胸痹心痛、瘀滯腹痛、胸脅刺痛、跌撲損傷、瘡瘍腫痛等[3]。有研究表明，在治療動脈粥樣硬化中，紅花具有抗炎、抗血小板聚集、抗缺血作用，但具體機(jī)制不明[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，對藥物有效成分進(jìn)行多靶點、多途徑的生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)圖分析[5]。從中醫(yī)學(xué)角度闡明中藥成分-靶點-疾病基因之間的關(guān)系、尋找發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵靶點及通路可為疾病的臨床治療提供理論依據(jù)。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選紅花中的有效化學(xué)成分，預(yù)測其與動脈粥樣硬化相關(guān)的靶點及信號通路?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 紅花化學(xué)成分及靶點收集 紅花的化學(xué)成分及靶點通過傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Databaseand Analysis Platform，TCMSP；http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)獲得。該數(shù)據(jù)庫和分析平臺包括化學(xué)成分、靶點、藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)、相關(guān)的藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，以及天然化合物的藥代動力學(xué)特性，如口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、類藥性(drug-likeness，DL)、血腦屏障等[6]。根據(jù)吸收、分布、代謝和排泄篩選化學(xué)成分，并利用藥代動力學(xué)信息檢索篩選出閾值OB≥30.00%、DL≥0.18的化學(xué)成分進(jìn)一步分析[7-8]。經(jīng)TCMSP檢索的靶蛋白通過蛋白數(shù)據(jù)庫(Uniprot；https://www.uniprot.org/)[9]將蛋白名稱轉(zhuǎn)換為基因ID名稱。

1.2 動脈粥樣硬化靶點收集動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病靶基因 從DisGeNET和GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲得靶基因，去除重復(fù)的靶點。通過ImageGP平臺將紅花中有效成分對應(yīng)的靶點和動脈粥樣硬化的疾病靶點進(jìn)行匹配重合[10]，繪制韋恩圖，獲得紅花中具有治療動脈粥樣硬化作用的關(guān)鍵靶點。

1.3 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 采用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)[11]進(jìn)行靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，將紅花與動脈粥樣硬化共同的靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)置為“Homo Sapiens”，獲得靶點相互作用信息。將結(jié)果導(dǎo)入到Cytoscape軟件[12]，繪制并分析交互網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點大小、顏色深淺與Degree值相對應(yīng)，即節(jié)點越大、顏色越深代表Degree值越高。

1.4 生物功能注釋基因富集分析和基因組百科全書代謝通路富集分析 采用Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)[13]對紅花治療動脈粥樣硬化的關(guān)鍵靶點進(jìn)行生物功能注釋(Gene Ontology，Go)基因富集分析和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)代謝通路富集分析，分析紅花中的主要分子生物過程和信號通路，其中，Go富集和KEGG通路富集分析的結(jié)果均以條形圖的形式進(jìn)行展示。

2 結(jié)果

2.1 紅花活性成分篩選 紅花的化學(xué)成分有23個，其中，16個化學(xué)成分滿足OB≥30.00%、DL≥0.18(表1)。

表1 紅花有效活性成分表

2.2 紅花活性成分的潛在靶點預(yù)測 紅花中有449個預(yù)測靶點，剔除重疊靶點后，得到178個靶點。具有靶點最多的活性成分是槲皮素，然后依次是木犀草素、山奈酚、黃芩苷、β-谷甾醇、豆甾醇，靶點個數(shù)分別為128、57、51、30、27、23個。

2.3 動脈粥樣硬化潛在靶點預(yù)測 紅花中具有治療動脈粥樣硬化作用的關(guān)鍵靶點有55個(圖1，表2)。

圖1 紅花與動脈粥樣硬化靶基因匹配圖

表2 紅花潛在靶點信息列表

2.4 紅花與動脈粥樣硬化共同靶點分析 將紅花與動脈粥樣硬化共同的55個靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，獲得了包含55個節(jié)點和850條邊的網(wǎng)絡(luò)圖，平均節(jié)點度值為30.91。Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，關(guān)聯(lián)強(qiáng)度前10位的靶點分別是白細(xì)胞介素-6、白蛋白、腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮生長因子、白細(xì)胞介素-8、趨化因子2、蘇氨酸激酶1、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9、白細(xì)胞介素-1β(圖2)。

2.5 關(guān)鍵靶基因Go分析 Go-細(xì)胞成分分析可見，富集前9位細(xì)胞成分主要是小窩蛋白、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)、分泌顆粒腔隙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔、富含F(xiàn)icolin-1顆粒腔、蛋白質(zhì)-基因復(fù)合物、質(zhì)膜外側(cè)、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物(圖3a)。Go-分子功能分析可見，富集前10位分子功能主要是細(xì)胞因子活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞核受體活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、血紅素結(jié)合、整合素結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚體活性、蛋白激酶結(jié)合(圖3b)。Go-生物學(xué)過程分析可見，富集前10位生物學(xué)過程主要是細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的信號通路、對脂多糖的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、活性氧代謝過程、白細(xì)胞-細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞遷移、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、凋亡信號通路的調(diào)控(圖3c)。

圖2 紅花治療動脈粥樣硬化的靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.6 關(guān)鍵靶基因KEGG分析 對55個關(guān)鍵靶基因進(jìn)行KEGG分析，并以P<0.01為閾值篩選出前10條通路，分別為流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、白細(xì)胞介素-17信號通路、瘧疾、癌癥途徑、HIF-1信號通路、弓形蟲病、丙型肝炎、T細(xì)胞受體信號通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、HTLV-Ⅰ感染(圖4)。

圖3 紅花有效化學(xué)成分潛在靶點Go分析(a.細(xì)胞成分分析；b.分子功能分析；c.生物學(xué)過程分析)

圖4 紅花有效化學(xué)成分潛在靶點KEGG分析

3 討論

動脈粥樣硬化是臨床常見疾病，致病過程復(fù)雜，中醫(yī)根據(jù)其臨床癥狀將其歸屬于“中風(fēng)”“眩暈”“偏枯”等范疇[14]。中藥紅花對心肌缺血、心肌梗死等心血管疾病具有良好的療效，但關(guān)于其治療動脈粥樣硬化相關(guān)靶點和信號通路的研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，紅花中具有治療動脈粥樣硬化作用的化學(xué)成分主要是槲皮素、木犀草素、山奈酚、黃芩苷、β-谷甾醇、豆甾醇等。炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。有研究報道，槲皮素可通過調(diào)節(jié)AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而減輕糖尿病高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠頸動脈粥樣硬化[15]。木犀草素是一種存在于多種藥材中的天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗纖維化等藥理作用。木犀草素能夠通過調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來改善高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化[16]。氧化低密度脂蛋白會誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，山奈酚通過抑制TLR4/NF-κB通路上調(diào)miR-26a-5p，減輕氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，防治動脈粥樣硬化[17]。黃芩素是一種有效的抗動脈粥樣硬化的化合物，可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮作用[18]。

紅花可通過調(diào)節(jié)多個靶點，如白細(xì)胞介素-6、白蛋白、腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮生長因子、白細(xì)胞介素-8、趨化因子2、蘇氨酸激酶1等靶蛋白在改善動脈粥樣硬化中發(fā)揮作用。通過對紅花抗動脈粥樣硬化的核心靶點進(jìn)行KEGG分析發(fā)現(xiàn)，紅花主要通過流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、白細(xì)胞介素-17信號通路、HIF-1信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等治療動脈粥樣硬化。NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)通路在動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[19]，NF-κB活性增強(qiáng)能夠促進(jìn)白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子表達(dá)，損傷血管內(nèi)皮損傷，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附[20]。血管內(nèi)皮生長因子可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、巨噬細(xì)胞浸潤、泡沫細(xì)胞形成，影響動脈粥樣硬化發(fā)病[21]。白細(xì)胞介素-8是一種炎癥因子，G31P可拮抗白細(xì)胞介素-8受體，通過調(diào)節(jié)Rho激酶、ERK和鈣依賴通路抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[22]。單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在動脈粥樣硬化病變的早期積聚，白細(xì)胞的積聚受到其與激活內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的調(diào)控，這種調(diào)控由內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子、趨化因子及其各自的受體協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，動脈血管趨化因子2表達(dá)上調(diào)會促進(jìn)白細(xì)胞向動脈粥樣硬化病變遷移[23]。除了炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，脂質(zhì)浸潤、血管平滑肌細(xì)胞激活、免疫反應(yīng)等均參與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。由此可見，紅花主要通過調(diào)節(jié)炎癥、氧化應(yīng)激及免疫反應(yīng)等治療動脈粥樣硬化。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法探討紅花治療動脈粥樣硬化的活性成分、靶點及作用機(jī)制，通過構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖直觀地發(fā)現(xiàn)紅花治療動脈粥樣硬化具有多成分-多靶點-多途徑的特點，與中醫(yī)藥治療疾病的特點相吻合，相較于西藥單一作用，其優(yōu)勢更佳明顯。