王繼凡 張?zhí)?丁翰林 董高超 許林 蔣峰

據(jù)全球癌癥流行病學數(shù)據(jù)GLOBOCAN 2020年的統(tǒng)計顯示，肺癌的發(fā)病率和死亡率在全部惡性腫瘤中居于首位（全部人群）[1]。我國的肺癌發(fā)病率和死亡率也逐年上升，部分原因可能是低劑量計算機斷層掃描（computed tomography,CT）的普及使得肺癌的檢出率逐漸升高。多原發(fā)性肺癌（multiple primary lung cancer,MPLC）也越來越多的被人們發(fā)現(xiàn)和認識。MPLC是指在同一患者肺內(nèi)不同部位同時或先后發(fā)生兩個或兩個以上原發(fā)病灶的肺癌，以診斷時間間隔6個月為界，MPLC分為同時性MPLC（synchronous multiple primary lung cancer,sMPLC）和異時性MPLC（metachronous multiple primary lung cancer,mMPLC）[2,3]。在臨床上，MPLC以腺癌多見，常需要與肺癌肺內(nèi)轉(zhuǎn)移（intrapulmonary metastasis,IM）相鑒別，二者的治療方法也截然不同。研究[4]發(fā)現(xiàn)，MPLC和IM預(yù)后存在明顯的差異。因此，準確地對MPLC尤其是sMPLC和IM進行鑒別顯得尤為重要。然而，目前臨床工作中對于二者的鑒別仍沒有達成共識。本文主要從組織病理學、影像學和分子遺傳學三個角度總結(jié)了近年來用來鑒別sMLPC和IM的方法。

1 組織病理學

組織病理學是診斷肺癌的金標準，但是當多灶性肺癌表現(xiàn)同一種組織學類型，尤其是腺癌時，其很難將sMPLC和IM進行有效的區(qū)分。Martini和Melamed[2]在1975年給出了MPLC的診斷標準并首次提出sMPLC和mMPLC的概念。sMPLC指兩個腫瘤孤立，病理類型可能相同或不同。在病理相同的情況下，腫瘤一般分布在不同肺段、肺葉或不同側(cè)肺，腫瘤原位起源且沒有肺外轉(zhuǎn)移或淋巴擴散的證據(jù)。Martini標準雖然缺乏區(qū)分sMLPC和IM的方法，但是仍具有重大臨床意義。1995年Antakli等[5]對該標準進行了補充，增加了DNA倍體檢測來區(qū)分MPLC和IM，但是由于技術(shù)及經(jīng)濟效益的制約，并未得到廣泛應(yīng)用。2003年，美國胸科醫(yī)師協(xié)會（American College of Chest Physicians,ACCP）推薦了新的MPLC診斷標準[6]，并于2007年[7]和2013年[8]做出了更新。ACCP標準對于sMPLC診斷增加了分子遺傳學的特征，特別強調(diào)了MPLC的診斷需要多學科聯(lián)合，在一定程度上解決了MPLC和IM鑒別難題。

綜合組織學評估（comprehensive histologic assessment,CHA）的方法在2009年由Girard等[9]提出。CHA通過更加詳細地評估多個病變之間病理特征的差異來區(qū)分轉(zhuǎn)移和多原發(fā)。其不僅評估了以10%為增量的組織學亞型的百分比，而且還評估了細胞學和基質(zhì)特性。如果腫瘤對具有不同的組織學類型，或者癌癥的主要亞型不同（即腺泡、乳頭），或者當腫瘤對為鱗狀細胞癌時，細胞和基質(zhì)特征不同，則將腫瘤視為MPLC。如果腫瘤的組織學類型或細胞學和基質(zhì)特征百分比相似，則認為他們是腫瘤內(nèi)轉(zhuǎn)移。該方法分類結(jié)果與分子分類的方法高度一致。在此基礎(chǔ)上，研究發(fā)現(xiàn)將CHA和其他病理因素相結(jié)合可以進一步提高判斷的準確性。Sun等[10,11]通過CHA與低等級鱗狀細胞成分或伴輕度核型異型的非黏液性鱗狀細胞性病變相結(jié)合的方法來鑒別sMLPC和IM，與單純的CHA方法相比，鑒別準確性有了明顯提升。盡管這些方法提供了更準確的鑒別可能，但是它們?nèi)匀恍枰蟮臉颖救ミM一步證實。

總體來說，組織病理學的方法依舊是目前鑒別sMPLC和IM最可靠易行的方法之一。經(jīng)過多年不斷的發(fā)展，人們對于MPLC的病理學認識逐漸完善、細化。CHA及其衍生的其他方法是目前臨床上用來判斷MPLC和IM的主要方法，很多其他方法也常用CHA等作為參考標準，但是它們也有著自己的局限。比如它們的判斷基于術(shù)后的病理，未能在術(shù)前對治療提供準確的指導；需要獲得足量的腫瘤樣本；基于醫(yī)生主觀的判斷等。這些不足在一定程度上造成了其在臨床應(yīng)用中的困擾。

2 影像學

影像學檢查是肺癌篩查的“前哨兵”，幾乎所有肺癌患者的首次發(fā)現(xiàn)均是通過影像學。胸部CT或正電子發(fā)射型計算機斷層顯像（positron emission computed tomography,PET）‐CT是目前術(shù)前鑒別MLPC和IM的主要方法，臨床醫(yī)生常通過多個病灶的形態(tài)、腫瘤倍增時間等來綜合判斷，但是缺乏相對統(tǒng)一的標準，主觀性較強。多灶性肺癌結(jié)節(jié)根據(jù)實性成分的多少在CT上常被分為以下4類：純毛玻璃樣結(jié)節(jié)/影（pure ground‐glass nodules/opacities,pGGNs/GGOs）、毛玻璃樣影為主的部分實性結(jié)節(jié)（GGO‐predominant part‐solid nodule,GGO‐PSN）、實性成分為主的部分實性結(jié)節(jié)、純實性結(jié)節(jié)[12]。結(jié)節(jié)內(nèi)實性成分越多，往往提示更有侵襲性的病理類型[13]。表現(xiàn)為GGOs的肺內(nèi)腫瘤被稱為多發(fā)毛玻璃/鱗狀（ground‐glass/lepidic,GG/L）肺癌，GG/L肺癌主要包括微浸潤腺（minimally invasive adenocarcinoma,MIA）、原位腺癌（adenocarcinoma in situ,AIS），通常被認為是獨立的原發(fā)癌[14]。因此，有研究[15]認為至少有一個GGO的多灶性肺癌可以簡單地認為是放射性MPLC。類似的結(jié)果也由Zhang等[16]的研究得出。但是兩個GGO之間被證明也可以通過氣腔播散（tumor spread through air space,STAS）的方式發(fā)生傳播[17]，也就是說表現(xiàn)為GGOs的多發(fā)GG/L肺癌并不能完全被認為是MPLC。

標準化攝取值（standardized uptake value,SUV）被認為可以用來區(qū)分sMPLC和IM。SUV是PET‐CT中常用的半定量指標，是指局部組織攝取的顯像劑的放射性活度與全身平均注射活度的比值。SUV被廣泛應(yīng)用于腫瘤良惡性的判斷和療效評價。Dijkman等[18]計算患者腫瘤對之間的SUV差異值（difference between SUVs,?SUV），統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)sMPLC患者的?SUV明顯高于轉(zhuǎn)移患者。Liu等[19]研究中得出了同樣的結(jié)果。但是這些結(jié)論仍需要更多證據(jù)。

簡單的用單一的指標去鑒別MPLC和IM顯然是不夠全面和準確的，Suh等[12]將CT的放射學特征和PET‐CT的SUV結(jié)合起來設(shè)計了一套新的算法去區(qū)分MPLC和IM。整個算法分為4個步驟：①腫瘤對是否至少有一個CT表現(xiàn)為GGO或GGO為主；②腫瘤對是否有毛刺征和支氣管征；③腫瘤對的?SUV是否超過兩個等級；④是否存在N2/N3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移。如果滿足以下條件之一，則將腫瘤對診斷sMPLC：任何腫瘤表現(xiàn)為具有純GGO或GGO優(yōu)勢特征；兩種腫瘤均帶有毛刺征或支氣管征；只有一個腫瘤帶有毛刺或支氣管征，并且腫瘤對具有超過兩個等級的?SUV；只有一個腫瘤帶有毛刺或支氣管征，且腫瘤對具有不超過兩個等級的?SUV，但是無N2/N3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移。這套算法得出來的結(jié)果與病理專家通過組織病理學審查結(jié)果高度一致。盡管這套算法仍缺乏足量的數(shù)據(jù)去支撐，但是其實現(xiàn)了在手術(shù)之前進行評估，對于更加精準的患者進行下一步的治療指導有著重大的意義。

人工智能和深度學習的長足發(fā)展使得其在病理學、影像學、腫瘤學等醫(yī)學領(lǐng)域有了諸多應(yīng)用[20,21]。這些技術(shù)的主要應(yīng)用一直是肺結(jié)節(jié)的檢測和分類。目前通過機器學習算法分析放射影像的特征來進行肺結(jié)節(jié)的檢測、良惡性判斷的水平達到甚至超過了人類專家[22,23]，甚至可以用來預(yù)測表現(xiàn)為GGO的結(jié)節(jié)進一步惡化的可能性[24]。然而，人工智能應(yīng)用于MPLC和IM鑒別鮮有報道。因此，基于機器學習的圖像分析可能代表了一種在多灶性肺癌患者中識別MPLC和IM的新方法。

3 分子遺傳學

隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的進步和發(fā)展，分子遺傳學和分子生物學分析手段被更多地應(yīng)用到多原發(fā)肺癌的鑒別診斷中。早在1995年Antakli等[5]對Martini和Melamed的標準進行補充時就增加了采用DNA倍體檢測來區(qū)分MPLC和IM，但是由于技術(shù)及經(jīng)濟效益的制約，并未得到廣泛應(yīng)用。隨著測序技術(shù)的不斷進步，越來越多的證據(jù)用來支持MPLC的獨立克隆起源[25]，這可能有助于IM和MPLC的鑒別診斷。目前，點突變、DNA甲基化、染色體重排等測序技術(shù)被報道可以用來區(qū)分MPLC和IM。

下一代測序技術(shù)（next generation sequencing,NGS）的蓬勃發(fā)展使得人們能夠檢測的基因數(shù)目不斷擴大。最初人們只對少數(shù)的明星基因進行測序如p53、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten ratsarcoma viral oncogene,KRAS）等來輔助診斷[26,27]。這些研究往往基于一個或者兩個熱點突變基因來鑒別MPLC和IM。Girard等[28]提出，腫瘤對之間發(fā)生相同基因變化的可能性主要由基因突變頻率決定，即如果多個腫瘤共享同一突變基因，如果這個基因的突變頻率越低，多個腫瘤屬于同一克隆起源的可能性越大，診斷價值愈大。相比之下，具有相同高頻基因突變的患者在診斷他們的克隆來源是否相同時需要更加謹慎。隨后Liu等[29]發(fā)現(xiàn)診斷為IM的同一患者不同肺腫瘤均可出現(xiàn)EGFR p.L858R突變和EGFR外顯子19缺失突變等熱點基因突變，但在其他基因位點具有明顯的突變差異。此外，在不同組織病理學類型的多個肺腫瘤中可以檢測到相同的熱點基因突變。因此很難簡單地通過幾個熱點突變就做出準確判斷。Roepman等[30]指出對于類似于EGFR和KRAS的熱點突變，多原發(fā)性腫瘤中偶然共享一個熱點驅(qū)動基因突變的可能性很高。擴大檢測基因數(shù)量，尤其是增加突變頻率不高的基因數(shù)目可以進一步減少誤差。Begg等[31]認為為了在統(tǒng)計學上達到更高的準確度，至少需要20個標記的基因突變位點來區(qū)別IM和MPL。一些對50個基因進行測序的研究[32‐36]表明，如果多個腫瘤具有不同的驅(qū)動突變，那么它們是獨立的；如果它們共享一個共同的驅(qū)動突變，那么它們是轉(zhuǎn)移性的。這些基于較大基因面板的分子分類方法可以有效地提升準確性。但與此同時，這些研究也都表明盡管IM中的原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的基因突變一致率大于90%，而在考慮為MPLC的多發(fā)肺腫瘤時，仍有不低的概率基因突變一致。也就是說，即便提高了檢測量，仍存在很大的誤判可能。在這種情況下，分子遺傳學和組織病理學結(jié)合成為更合理有效的選擇。Mansuet‐Lupo等[37]已經(jīng)提出了一種針對MPLC的集成組織分子算法。當多個腫瘤共享一個頻繁的熱點突變（EGFR外顯子19缺失或EGFR p.L858R或KRAS p.G12X）時，組織學算法是決定性的。此外，全基因組測序（whole genome sequencing,WGS）為克隆性評估提供了更全面的信息，但是由于其高成本和對腫瘤樣品的要求，因此在臨床環(huán)境中不切實際?？偟膩碚f，基于NGS技術(shù)的分子分類能夠提供一種更加有效適用的方法。但是仍然存在一些問題，比如如何進一步提高準確性？盡管更大的基因面板測序甚至WGS可以在一定程度上解決這個問題，但并不能全面推廣。其次當測序方法與病理組織方法矛盾時，誰是更準確的？這些問題需要進一步解決，但不能否定NGS技術(shù)在MPLC和IM鑒別方面的重大意義。

DNA甲基化（DNA methylation）指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase,Dnmt）的作用下將甲基選擇性地添加到胞嘧啶上形成5‐胞嘧啶的過程，為DNA化學修飾的一種形式，能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)。每種細胞類型都有獨特的DNA甲基化譜，可作為追蹤任何腫瘤細胞來源的工具[38]。Sano等[39]報告了一種分析十種基因啟動子甲基化狀態(tài)的系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)IM腫瘤對之間具有相同的甲基化譜，而MPLC卻不同。它為鑒定多種肺癌的克隆關(guān)系提供了一種新工具。

染色體重排（chromosomal rearrangement）指斷裂的染色體在重接過程中發(fā)生異常連接，導致染色體結(jié)構(gòu)變異的現(xiàn)象。通常把染色體重排分為重復、缺失、倒位和易位四種類型。Murphy等[40,41]用配對測序技術(shù)檢測了體細胞斷點連接，以確定腫瘤的譜系，MLPC腫瘤對中沒有任何共同的基因組重排。而在IM患者中，在所有腫瘤對中均發(fā)現(xiàn)了共同的重排，這似乎可以用來鑒別MLPC和IM。

在蛋白質(zhì)水平上，報道有了4種與癌癥相關(guān)的蛋白質(zhì)（p53、p16、p27和c‐erbB2）在MPLC中差異表達。如果腫瘤之間4種蛋白質(zhì)表達比率差異的總和大于90，則將診斷為MPLC[25,42]。此外，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability,MSI）和雜合性丟失（loss of heterozygosity,LOH）這兩種現(xiàn)象都代表了細胞轉(zhuǎn)化為惡性的過程中所發(fā)生的分子異常，將可用于區(qū)分多原發(fā)和轉(zhuǎn)移[43,44]，但是因為成本和技術(shù)原因難以推行。總而言之，分子分類在MLPC和IM的鑒別中有著獨特的無可取代的作用，隨著分子技術(shù)的不斷的進步，我們相信越來越準確便攜的方法會被開發(fā)及推廣。

4 臨床診斷方法概述

目前對于sMPLC和IM的鑒別診斷需要結(jié)合影像、病理和分子特征來進行全面評估。對于未手術(shù)或術(shù)前患者，在沒有取得腫瘤組織樣本時，可考慮使用影像綜合評估的方法來進行判斷（圖1）[12]。按照圖1所示流程逐步將多灶性肺癌分為sMPLC和IM。如果滿足以下條件之一，則將腫瘤對診斷為sMPLC：腫瘤中至少有一個表現(xiàn)為純GGO或GGO為主；腫瘤對均帶有毛刺征或支氣管征；只有一個腫瘤帶有毛刺或支氣管征，并且腫瘤對具有超過兩個等級的?SUV；只有一個腫瘤帶有毛刺或支氣管征，且腫瘤對具有不超過兩個等級的?SUV，但是無N2/N3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移。對于術(shù)后取得腫瘤組織樣本的患者，若進行了NGS檢測，則首先采用分子分類的算法（圖2）[9,37]。當NGS未檢測到突變，這時可以采用CHA進一步分析。當腫瘤對有突變且突變不同時，定義為sMLPC。當腫瘤對有兩個及以上共同突變時，定義為IM。當腫瘤對共享一個常見的熱點突變（EGFR外顯子19缺失或EGFR p.L858R或KRAS p.G12X），需要進一步采用CHA的方法來評估。當腫瘤對共享一個其他的非熱點突變包括TP53，可以直接定義為IM。若患者未進行NGS分析，則直接采用CHA來進行分類（圖3）。首先需要病理專家根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）2015年肺癌病理分類標準對患者進行病理分類評價。將百分比最高的成分定義為主要成分（如腺泡型、乳頭型等）。然后采用圖3的流程來劃分sMLPC和IM。滿足以下條件之一，將腫瘤對診斷為sMLPC：腫瘤對至少有一個為AIS或MIA；腫瘤對具有不同的組織學類型；腫瘤對組織類型相同，主要成分不同，且腫瘤對在細胞學、基質(zhì)特征上不同；腫瘤對組織類型相同，主要成分相同（主要成分為常見類型，如乳頭狀、腺泡型等），但是腫瘤對在細胞學、基質(zhì)特征上不同。

圖1 綜合影像學評估流程圖Fig 1 Flowchart of radiological assessment.GGN:ground-glass nodules; GGO:ground-glass opacities; MPLC:multiple primary lung cancer; IM:intrapulmonary metastasis; SUV:standardized uptake value; ?SUV:difference between SUVs.

圖2 分子分類算法流程圖Fig 2 Flowchart of molecular algorithm.AIS:adenocarcinoma in situ; MIA:minimally invasive adenocarcinoma; CHA:comprehensive histologic assessment; EGFR:epidermal growth factor receptor; KRAS:kirsten rat sarcoma viral oncogene; TP53:tumor protein 53.

圖3 綜合組織評估流程圖Fig 3 Flowchart of comprehensive histologic assessment

5 結(jié)論與展望

隨著我國醫(yī)療檢測水平的不斷提高，尤其是影像學技術(shù)的進步，越來越多的多發(fā)肺癌被檢測出來，而sMLPC和IM的鑒別仍是棘手問題。目前臨床對于二者的區(qū)分更多依賴于醫(yī)生的經(jīng)驗，而缺乏相對統(tǒng)一的標準。組織病理學、影像學、分子遺傳學的發(fā)展為進一步提高判斷能力提供了可能。組織學上，CHA及相關(guān)改進方法成為臨床主流，但存在一定的局限。影像學方面，綜合影像學分析會成為術(shù)前判斷的利器。分子遺傳學的進步為更加精準地鑒別sMPLC和IM提供了更多可能。可以大膽預(yù)測，未來對于MLPC和IM的鑒別絕不是單一學科可以解決的，多學科的聯(lián)合會是最佳的出路。人工智能和機器學習的興起，將會帶來全新的解決思路，尤其在術(shù)前診斷方面有著不可替代的作用。測序的不斷進步和深入，加之與組織病理學的聯(lián)合，將會成為未來診斷sMLPC的新標準。