馬麗 秦娜 張新勇 吳羽華 李浩洋 俞孟軍 劉子臣 王敬慧

人表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）酪氨酸激酶拮抗劑（tyrosine kinase inhibitor,TKI）是治療攜帶EGFR敏感突變晚期非小細(xì)胞肺癌（non‐small cell lung cancer,NSCLC）患者的一線(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)治療，但大部分患者會(huì)在12個(gè)月內(nèi)發(fā)生耐藥，耐藥后的治療方法有限[1,2]。自2018年以來(lái)，隨著免疫治療在不同瘤種的廣泛應(yīng)用，研究者們?cè)噲D寄希望于將免疫治療應(yīng)用到EGFR突變的人群中[3,4]，但前期研究[5]表明，EGFR突變的人群由于生物學(xué)特性不同，驅(qū)動(dòng)型癌基因?qū)е旅庖咭种萍せ畹耐份^多，免疫微環(huán)境存在較多抑制信號(hào)。EGFR突變?nèi)巳阂欢缺徽J(rèn)為是“免疫豁免”人群。一些臨床試驗(yàn)和meta分析[4,6]也提示單藥免疫治療EGFR突變?nèi)巳旱墨@益有限，療效均劣于EGFR野生型患者。然而，IMpower150研究[7]為了探索不同免疫聯(lián)合方案在EGFR突變?nèi)巳褐械膬r(jià)值，設(shè)計(jì)了EGFR突變的亞組，研究結(jié)果表明，程序性死亡配體1（programmed death‐ligand 1,PD‐L1）抑制劑聯(lián)合化療和抗血管生成治療的總生存時(shí)間（overall survival,OS）較化療聯(lián)合抗血管生成治療的患者顯著延長(zhǎng)（29.4個(gè)月 vs 18.1個(gè)月，HR=0.6，95%CI：0.31‐1.41）。這一國(guó)際多中心研究顛覆了人們對(duì)“EGFR突變免疫豁免”的理論，為免疫治療在EGFR突變?nèi)巳褐械膽?yīng)用增加了信心，也為EGFR‐TKI耐藥的患者帶來(lái)新的治療選擇。因此，本研究通過(guò)評(píng)估人源化的程序性死亡受體1（programmed death protein 1,PD‐1）單抗聯(lián)合化療以及抗血管生成治療EGFR突變的NSCLC患者的療效，為EGFR突變患者靶向治療耐藥后的治療策略和全程管理提供臨床經(jīng)驗(yàn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集自2018年6月‐2020年11月的晚期肺腺癌病例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診為肺腺癌；②組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)基因檢測(cè)曾有EGFR敏感突變；③曾接受EGFR‐TKI藥物口服治療；④美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG）評(píng)分0分‐2分；⑤均為EGFR‐TKI靶向治療進(jìn)展的患者，臨床分期IIIb期‐IV期［根據(jù)第8版腫瘤原發(fā)灶‐淋巴結(jié)‐轉(zhuǎn)移（tumor‐node‐metastasis,TNM）分期］；其中，一代、二代藥物進(jìn)展后，若有T790M突變的患者接受奧西替尼治療進(jìn)展后；⑥有完整的臨床病理信息，包括吸煙、性別、年齡和臨床分期等；⑦TKI進(jìn)展后接受了免疫治療（PD‐1抑制劑）聯(lián)合化療和抗血管生成治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜18歲；②已懷孕女性；③合并其他惡性腫瘤病史；④有間質(zhì)性肺炎等免疫治療禁忌證。共納入27例晚期肺腺癌患者。

1.2 基因檢測(cè)方法

1.2.1 突變擴(kuò)增系統(tǒng)（amplification refractory mutation system,ARMS）技術(shù)檢測(cè)患者腫瘤組織和血液中EGFR基因突變類(lèi)型 每例患者在入組時(shí)均已明確EGFR基因突變類(lèi)型。由我院病理科提供石蠟切片標(biāo)本，QIAamp DNA試劑盒定量提取石蠟切片腫瘤組織的DNA[9]。通過(guò)ARMS‐PCR技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中EGFR基因突變類(lèi)型，廈門(mén)艾德公司ADx‐ARMS試劑盒檢測(cè)29種突變類(lèi)型，試劑盒設(shè)有內(nèi)部和外部質(zhì)控樣本，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。通過(guò)Super‐ARMS技術(shù)檢測(cè)血液標(biāo)本中EGFR基因突變情況[10]。

1.2.2 檢測(cè)方法 腫瘤組織或細(xì)胞學(xué)標(biāo)本用4%的甲醛溶液浸泡，經(jīng)過(guò)包埋固定后制成石蠟切片。蘇木精‐伊紅（Hematoxylin‐Eosin,HE）染色，在顯微鏡下病理學(xué)專(zhuān)家進(jìn)行細(xì)胞類(lèi)型確診，保證至少80%以上的腫瘤細(xì)胞成分。QIAamp DNA試劑盒定量提取石蠟切片腫瘤組織的DNA。收集外周血至一管10 mL EDTA‐K2抗凝管中，在2 h內(nèi)處理血標(biāo)本。全血1,600 rpm離心10 min。收集上清液后以16,000 rpm 4oC離心10 min。此次收集的上清液為血漿，分裝保存至‐80oC。利用QIAamp循環(huán)腫瘤核酸試劑盒提取血漿循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）。分離后的DNA保存在‐80oC。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。依據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST）1.1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腫瘤治療療效評(píng)估。治療后每6‐8周進(jìn)行全身評(píng)估，完善血液學(xué)檢查，評(píng)價(jià)治療療效和病情變化。通用不良事件術(shù)語(yǔ)標(biāo)準(zhǔn)（Common Terminology Criteria Adverse Events,CTCAE）5.0評(píng)價(jià)毒副反應(yīng)?？陀^緩解率（objective response rate,ORR）為經(jīng)過(guò)免疫治療后完全緩解（complete response,CR）和部分緩解（partial response,PR）患者除以總的可評(píng)價(jià)病例數(shù)。疾病控制率（disease control rate,DCR）指腫瘤縮小或穩(wěn)定且保持一定時(shí)間的患者的比例，包含CR、PR和疾病穩(wěn)定（stable disease,SD）的病例。無(wú)進(jìn)展生存期（progression‐free survival,PFS）指有EGFR基因敏感突變的肺癌患者從接受免疫治療開(kāi)始，到觀察到疾病進(jìn)展（progressive disease,PD）或發(fā)生因任何原因死亡的時(shí)間。OS為從免疫治療開(kāi)始至（因任何原因）死亡的時(shí)間。末次隨訪時(shí)間為2020年12月30日。中位隨訪時(shí)間為19.7個(gè)月（1.0個(gè)月‐26.0 個(gè)月）。Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行兩組生存比較，ORR和DCR通過(guò)Fisher’s檢驗(yàn)比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)Kaplan-Meier法分析患者PFS和OS。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征 本研究共納入患者27例，所有患者均為靶向治療耐藥后接受PD‐1單抗聯(lián)合化療和貝伐珠單抗治療，其中免疫治療包括特瑞普利單抗、信迪利單抗或卡瑞利珠單抗治療，化療均為培美曲塞聯(lián)合鉑類(lèi)方案。4個(gè)周期后行PD‐1單抗聯(lián)合維持治療貝伐珠單抗維持治療，每3周一次，直至PD或無(wú)法耐受不良反應(yīng)。入組患者中，男12例（44.4%,12/27），女15例（55.6%,15/27）。平均年齡（57±10）歲，≤65歲者占63.0%（17/27）。不吸煙或少吸煙者占70.4%（19/27）。按照第八版TNM分期，所有患者入組時(shí)均已出現(xiàn)局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，所有患者入組前均接受靶向治療，ECOG評(píng)分0分‐1分為17例（63.0%），2分為10例（37.0%）。均接受PD‐1抑制劑聯(lián)合化療和貝伐珠單抗治療，其中化療方案均為培美曲塞聯(lián)合鉑類(lèi)，PD‐1抑制劑包括特瑞普利單抗11例（40.8%）、信迪利單抗8例（29.6%）和卡瑞利珠單抗8例（29.6%）（表1）。

表1 所有患者的臨床病理特征（n=27）Tab 1 Clinicopathologic characteristics of all patients (n=27)

2.2 肺腺癌患者腫瘤組織和血液EGFR基因突變情況 免疫治療前所有標(biāo)本均為EGFR基因突變病例，6例EGFR 19del突變（22.2%），8例EGFR L858R突變（29.6%），合并T790M突變的有8例（29.6%），其他EGFR少見(jiàn)突變?yōu)?例（18.5%）。其中，1例為EGFR 20Ins突變，4例為EGFR G719X突變。在8例T790M突變的患者中，血液標(biāo)本中有2例未發(fā)現(xiàn)T790M突變，其余血液標(biāo)本與組織標(biāo)本的EGFR基因突變完全一致。

2.3 療效分析 通過(guò)隨訪分析，所有患者中，近期療效達(dá)到CR為0例，達(dá)到PR為11例（40.7%），達(dá)到SD為11例（40.7%），達(dá)到PD為5例（18.6%）（表2）?？傮wORR為40.7%（95%CI:12.5%‐66.7%），DCR為81.48%（95%CI:62.5%‐100%）。未合并T790M患者ORR明顯優(yōu)于合并T790M的患者（52.63% vs 12.5%,P=0.045）（表2）。所有突變類(lèi)型的患者中位PFS為6.8個(gè)月（95%CI:0.7‐17.1），中位OS為10.2個(gè)月（95%CI:1.0‐22.6）。EGFR 19del突變、L858R突變、EGFR少見(jiàn)突變以及含有T790M突變的4組患者接受免疫四藥聯(lián)合治療的中位PFS無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（分別為10.3個(gè)月、5.4個(gè)月、6.2個(gè)月和3.3個(gè)月，χ2=4.15，P=0.23），同樣，未觀察到中位OS的差異（分別為13.1個(gè)月、11.5個(gè)月、10.4個(gè)月和7.3個(gè)月，χ2=2.35，P=0.502）（圖1A、圖1B）。而未合并T790M突變的患者PFS較合并T790M突變的患者顯著延長(zhǎng)（9.2個(gè)月 vs 3.3個(gè)月，χ2=2.81，P=0.041），兩者OS未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（12.2個(gè)月 vs 7.3個(gè)月，χ2=3.22，P=0.062）（圖2A、圖2B）。

圖1 Kaplan-Meier法分析免疫聯(lián)合治療不同EGFR突變患者的無(wú)進(jìn)展生存期（A）和總生存時(shí)間（B）Fig 1 Kaplan-Meier analysis of progression-free survival (A) and overall survival (B) in EGFR-mutant patients treated with combined immunotherapy.

圖2 Kaplan-Meier法分析免疫聯(lián)合治療兩個(gè)亞組患者的生存情況。A：合并T790M突變與未合并T790M突變的無(wú)進(jìn)展生存期比較；B：合并T790M突變與未合并T790M突變的總生存時(shí)間比較。Fig 2 Kaplan-Meier analysis of survival in two subgroups treated with combined immunotherapy.A:Progression-free survival between patients with T790M patients and without T790M mutation；B:Over survival between patients with T790M patients and without T790M mutation.

表2 不同EGFR突變的患者接受免疫聯(lián)合治療的近期療效Tab 2 Short-term efficacy of combined immunotherapy in patients with different EGFR mutations

2.4 不良反應(yīng) 患者發(fā)生治療相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生率為92.6%，包括乏力、便秘、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase,AST）升高、貧血、白細(xì)胞減少、中性粒細(xì)胞減少、惡心、皮疹、甲狀腺功能減退、肺炎、反應(yīng)性皮膚毛細(xì)血管增生癥，未發(fā)現(xiàn)新的不良反應(yīng)（表3）。其中，≥3級(jí)的不良反應(yīng)為乏力1例，占總體人群的3.7%，停藥1個(gè)月后可自行緩解。其余均為1級(jí)‐2級(jí)，通過(guò)對(duì)癥支持治療均可恢復(fù)至正常。

表3 治療相關(guān)不良事件Tab 3 TRAE

3 討論

以免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的免疫治療已成為晚期NSCLC標(biāo)準(zhǔn)治療方案之一，一線(xiàn)治療的適應(yīng)證也已經(jīng)寫(xiě)入指南。肺癌免疫治療正向著新輔助治療方向推進(jìn)[11]。2019年9月，世界肺癌大會(huì)（World Conference on Lung Cancer,WCLC）更新了全球III期CheckMate 017/057臨床研究5年隨訪生存數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，納武利尤單抗治療組較化療組OS延長(zhǎng)達(dá)5倍（13.4% vs 2.6%,HR=0.68,95%CI:0.59‐0.78）[12]。在免疫單藥治療取得突破性進(jìn)展后，免疫聯(lián)合放療、化療及雙免疫治療使患者的療效進(jìn)一步提高，強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合是肺癌的治療趨勢(shì)。但不同的患者療效仍存在差異，研究者希望從中能篩選出免疫治療有效的患者進(jìn)行精準(zhǔn)治療。多數(shù)前期研究[3,4]亞組分析均提示EGFR/ALK基因突變的患者從免疫治療單藥中獲益甚微，但有研究[7,13,14]提示部分EGFR/ALK基因突變患者仍能從免疫聯(lián)合治療中獲益，給靶向治療患者帶來(lái)新的希望。因此，本研究在真實(shí)世界中，評(píng)價(jià)了靶向治療耐藥后接受免疫聯(lián)合治療的療效，分析免疫治療在這些患者中的治療價(jià)值。

本研究納入了接受EGFR‐TKI藥物治療耐藥的EGFR突變患者27例，這些患者后線(xiàn)均接受了PD‐1單抗聯(lián)合化療和貝伐珠單抗治療。患者均為晚期肺腺癌，化療方案為培美曲塞聯(lián)合鉑類(lèi)化療。四藥聯(lián)合治療后，所有突變類(lèi)型的患者中位PFS為6.8個(gè)月（95%CI:1.8‐8.6），中位OS為10.2個(gè)月（95%CI:1.0‐16.1）。IMpower150研究亞組分析中，同樣探索了EGFR突變非鱗癌NSCLC患者一線(xiàn)接受ABCP（化療聯(lián)合貝伐珠單抗和阿特利珠單抗治療組）的中位PFS為9.7個(gè)月（95%CI:6.9‐15.2），中位OS為19.0個(gè)月（95%CI:13.5‐18.5）[7]。本研究與Impower150用藥方案相似，四藥聯(lián)合治療，但應(yīng)用的是PD‐1單抗，同時(shí)為后線(xiàn)治療，患者多線(xiàn)治療后四藥聯(lián)合的療效仍能與一線(xiàn)治療媲美，但OS略差。由此提示，靶向治療的患者能從后線(xiàn)聯(lián)合免疫治療中獲益，但盡早地應(yīng)用免疫聯(lián)合治療，可能得到OS的改善。此外，2020年Lung Cancer雜志中報(bào)道了ATLANTIC研究更新結(jié)果，探索了Durvalumab單藥三線(xiàn)及后線(xiàn)治療晚期NSCLC患者的療效及安全性，其中也包含了驅(qū)動(dòng)基因突變陽(yáng)性的患者[13]。結(jié)果顯示，攜帶EGFR基因突變的患者，OS為16.1個(gè)月，優(yōu)于ALK突變組的6.3個(gè)月，但均優(yōu)于單純化療組。進(jìn)一步印證了本研究的了結(jié)論，在后線(xiàn)治療中免疫治療仍能發(fā)揮重要的作用。

自2018年開(kāi)啟免疫治療的元年，多項(xiàng)大型國(guó)際和國(guó)內(nèi)多中心研究已經(jīng)開(kāi)始探索如何將免疫治療更精準(zhǔn)地應(yīng)用在肺癌治療中。2020年中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（Chinese Society of Clinical Oncology,CSCO）和最新的2021版美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）指南均提示對(duì)于驅(qū)動(dòng)基因陽(yáng)性的患者，一線(xiàn)靶向治療的地位仍不可動(dòng)搖，盡管PD‐L1表達(dá)水平較高，但單藥免疫治療仍效果欠佳[15]?；谇捌诘难芯浚瑲W盟于2019年3月批準(zhǔn)阿特利珠單抗聯(lián)合貝伐珠單抗以及紫杉醇聯(lián)合卡鉑用于EGFR‐TKI耐藥后的患者的后線(xiàn)治療。同時(shí)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration,FDA）也批準(zhǔn)了阿特利珠單抗用于EGFR/ALK突變的轉(zhuǎn)移性NSCLC患者TKI耐藥后的二線(xiàn)治療[16]。此外，國(guó)內(nèi)1.1類(lèi)創(chuàng)新藥物也有了新的臨床數(shù)據(jù)，特瑞普利單抗聯(lián)合化療用于EGFR‐TKI治療失敗的EGFR突變陽(yáng)性T790M陰性晚期NSCLC患者的II期研究，提示意向人群（intention‐to‐treat,ITT）中總體ORR達(dá)到50%，DCR為87.5%[14]。與本研究的ORR和DCR相似?？寡苌芍委熀突熆赡軐?duì)免疫治療起到協(xié)同作用。由此可見(jiàn)，EGFR突變的患者靶向治療耐藥后線(xiàn)接受免疫聯(lián)合治療仍能獲益?；诖?，《2020 CSCO非小細(xì)胞肺癌診療指南》及《2020 CSCO免疫檢查點(diǎn)抑制劑臨床應(yīng)用指南》新增注釋推薦，特瑞普利單抗聯(lián)合化療用于EGFR‐TKI治療失敗的EGFR突變陽(yáng)性T790M陰性晚期NSCLC患者。雖然本研究應(yīng)用了培美曲塞聯(lián)合鉑類(lèi)的方案，但在四藥聯(lián)合方面，也為EGFR突變患者全程管理的后線(xiàn)治療提供了臨床數(shù)據(jù)。

本項(xiàng)研究的創(chuàng)新之處在于報(bào)道了EGFR不同突變類(lèi)型后線(xiàn)接受免疫聯(lián)合治療的療效差異，其中含有T790M突變的患者療效最差，但L858R與19del以及其他少見(jiàn)突變?cè)谶h(yuǎn)期療效上未見(jiàn)明顯差異。提示這類(lèi)患者可能需要根據(jù)耐藥機(jī)制探索新的有效治療方案。由于本研究樣本量較少，仍需要更多的數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究仍存在一些局限性：①對(duì)于腫瘤細(xì)胞PD‐L1以及腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden,TMB）未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，但部分研究顯示在靶向治療耐藥后對(duì)于免疫治療有效的患者可能PD‐L1和TMB明顯升高，微環(huán)境的重塑打破突變患者原有的免疫豁免機(jī)制[7]。需要?jiǎng)討B(tài)研究進(jìn)一步分析微環(huán)境變化在免疫治療中的作用；②本研究主要闡述了聯(lián)合免疫治療在EGFR‐TKI耐藥后仍能達(dá)到預(yù)期的治療獲益，但由于不同突變類(lèi)型的病例較少，亞組分析結(jié)論效力不足，需要更大樣本的研究探索四藥聯(lián)合的療效以及耐受性。

總之，驅(qū)動(dòng)基因陽(yáng)性的患者由于首先接受了靶向治療，OS較傳統(tǒng)治療已經(jīng)有了很大的提升。但由于靶向治療不可避免地出現(xiàn)耐藥，耐藥后的基因譜復(fù)雜，缺乏相應(yīng)的后續(xù)有效治療策略，探索免疫治療在這些患者后線(xiàn)治療的價(jià)值對(duì)于這部分患者的全程管理至關(guān)重要。將來(lái)仍需要更有效的分子標(biāo)志物或聯(lián)合指標(biāo)進(jìn)一步進(jìn)行精細(xì)分層，能更精準(zhǔn)地為患者制定有效的治療方案。

Author contributions

Ma L,Qin N and Wang JH conceived and designed the study.Ma L,Qin N,Zhang XY,Wu YH,Li HY,Yu MJ and Liu ZC enrolled patients,collected data,and performed the experiments.Ma L and Wang JH analyzed the data and provided critical inputs on design,analysis and interpretation of the study.Wang JH,Ma L and Qin N contributed to revision and editing of the manuscript.All authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.