李玉勤 顧瑩瑩 姜桔紅

肺癌作為發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，是引起全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。非小細(xì)胞肺癌（non‐small cell lung cancer,NSCLC）約占所有肺癌病例的85%，且預(yù)后情況不佳[2]。約60%的NSCLC患者因診斷時(shí)病情已處于晚期或伴有轉(zhuǎn)移無法進(jìn)行手術(shù)[3]，只能通過小活檢組織或細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行診斷。攜帶不同表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的一些特異性體細(xì)胞突變能預(yù)測NSCLC患者對(duì)各種酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）的反應(yīng)[4‐6]，選擇TKI藥物治療前需要檢測EGFR基因突變狀態(tài)。因此，現(xiàn)在肺癌的病理評(píng)估既需要通過組織形態(tài)學(xué)和免疫組化對(duì)腫瘤進(jìn)行準(zhǔn)確的分型，也需要通過腫瘤的分子分析確定EGFR基因突變狀態(tài)以選擇接受合適的TKIs治療[7,8]。小活檢標(biāo)本腫瘤細(xì)胞數(shù)量及比例均可能對(duì)檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，假陰性結(jié)果主要因?yàn)榛顧z樣本中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量或比例不足[9]。為了得出準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，在檢測前對(duì)標(biāo)本的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估是非常有必要的。本研究擬分析小活檢標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞比例、腫瘤細(xì)胞數(shù)量以及DNA濃度3個(gè)標(biāo)本質(zhì)量指標(biāo)對(duì)EGFR基因突變檢出率的影響，同時(shí)探討患者性別、年齡等臨床特征與EGFR基因突變檢出率的關(guān)系，旨在優(yōu)化臨床檢測方案，進(jìn)一步提高EGFR基因突變檢出率，延長患者的長期生存率。

1 材料與方法

1.1 臨床病例收集 本研究收集了2017年4月‐2020年7月期間廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院初次病理診斷為肺腺癌并于本院進(jìn)行了EGFR基因21種突變檢測的299個(gè)病例，均為小活檢標(biāo)本，取材方法包括經(jīng)支氣管鏡肺活檢術(shù)（transbronchial lung biopsy,TBLB）取材、經(jīng)皮肺穿刺取材以及經(jīng)超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下的經(jīng)支氣管針吸活檢（endobronchial ultrasound‐guided transbrochial needle aspiration,EBUS‐TBNA）取材。石蠟組織標(biāo)本處理由本院呼吸病理中心完成，DNA提取和擴(kuò)增以及檢測由本院轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室完成，采用廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司EGFR基因21種突變檢測試劑盒。于本院的臨床病例系統(tǒng)及病理信息系統(tǒng)查詢并收集每例患者的年齡、性別、腫瘤原發(fā)灶‐淋巴結(jié)‐轉(zhuǎn)移（tumor‐node‐metastasis,TNM）分期、吸煙史、標(biāo)本來源及其取材方法以及免疫組織化學(xué)結(jié)果等信息后，調(diào)取每例切片重新進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，并收集所有標(biāo)本進(jìn)行基因突變檢測的DNA濃度及檢測結(jié)果。

1.2 標(biāo)本質(zhì)量評(píng)估 我們對(duì)所有患者進(jìn)行診斷性免疫組化連續(xù)切片最后一張石蠟切片的腫瘤細(xì)胞數(shù)和比例進(jìn)行了重新評(píng)估。在光學(xué)顯微鏡下觀察整張切片每一塊小組織或?qū)⑶衅譃槿舾蓚€(gè)區(qū)域，依次計(jì)數(shù)每小塊組織或區(qū)域的腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算腫瘤細(xì)胞總的數(shù)量及比例作為標(biāo)本質(zhì)量評(píng)估的指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組統(tǒng)計(jì)采用行乘列表卡方檢驗(yàn)及Fisher確切概率法分析，采用單因素和多因素Logistic回歸分析各因素對(duì)突變檢出率的影響。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 本研究29 9例患者中男性占6 4.2%（192/299），女性占35.8%（107/299）；年齡范圍為27歲‐95歲，平均年齡為（61.3±11.1）歲。腫瘤TNM分期II期占1.0%（3/299），III期占32.1%（96/299），IV期占66.9%（200/299）。有吸煙史占47.5%（142/299），無吸煙史占52.5%（157/299）。免疫組化甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（thyroid transcription factor‐1,TTF‐1）陽性的標(biāo)本占89.3%（267/299），陰性占10.7%（32/299）。TBLB取材的標(biāo)本占40.1%（120/299），經(jīng)皮肺穿刺取材的標(biāo)本占19.4%（58/299），EBUS‐TBNA取材的標(biāo)本占40.5%（121/299）。

2.2 EGFR基因突變檢出情況 本次研究299例患者中共檢出130例患者的142個(gè)EGFR基因突變位點(diǎn)。單一位點(diǎn)突變有118例，分別為：2例外顯子18 G719X，61例外顯子19缺失，2例外顯子20插入突變、1例S768I，51例外顯子21 L858R、1例L861Q。合并EGFR基因2個(gè)位點(diǎn)突變有12例，其中3例外顯子18 G719A/719C合并外顯子21 L861Q，1例外顯子19缺失合并外顯子21 L858R，2例外顯子20 T790M合并外顯子19缺失；6例T790M合并外顯子21 L858R。

2.3 EGFR基因突變陽性率與臨床特征的關(guān)系 男性的EGFR基因突變陽性率為32.3%（62/192），女性陽性率為63.6%（68/107），兩者間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。年齡≤50歲組的陽性率為46.2%（18/39），＞50歲組的陽性率為43.1%（112/260），兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.718）。TNM分期II期組的陽性率為0%（0/3），III期組的陽性率為43.8%(42/96)，IV期組的陽性率44.0%（88/200），三者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.251）。有吸煙史組的陽性率為26.1%（37/142），無吸煙史組的陽性率為59.2%（93/157），兩者間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。免疫組化TTF‐1陽性組基因突變陽性率為47.6%（127/267），陰性組陽性率為9.4%（3/32），兩者間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。TBLB取材組的基因突變陽性率為48.3%（58/120），經(jīng)皮肺穿刺取材組的陽性率為37.9%（22/58），EBUS‐TBNA取材組的陽性率為41.3%（50/121），三者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.349）（表1）。

表1 299例的臨床特征及其與EGFR基因突變率的關(guān)系Tab 1 Clinical characteristics of the 299 cases and their relationship with EGFR gene mutation rate

2.4 EGFR基因突變檢出率與標(biāo)本質(zhì)量的關(guān)系 我們經(jīng)評(píng)估所有標(biāo)本的蘇木精‐伊紅染色法（hematoxylin‐eosin staining,HE）切片，其中對(duì)應(yīng)切片腫瘤細(xì)胞數(shù)＞500占91.0%（272/299），≤500占9.0%（27/299），腫瘤細(xì)胞數(shù)≤500組與＞500組的EGFR基因突變陽性率分別為40.7%（11/27）及43.8%（119/272），兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.764）（表2）。標(biāo)本提取的DNA濃度范圍：0.80 ng/μL‐645.30 ng/μL，中位數(shù)為20.4 ng/μL，濃度≤20.4 ng/μL組及＞20.4 ng/μL組的EGFR基因突變陽性率分別為42.7%（64/150）、44.3%（66/149），兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.776）（表3）。299例標(biāo)本對(duì)應(yīng)切片的腫瘤細(xì)胞比例范圍為10%‐90%，腫瘤細(xì)胞比例≤30%占22.7%（68/299），＞30%占77.3%（231/299），陽性率分別為29.4%（20/68）、47.6%（110/231），兩者間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.008）（表4）。299例標(biāo)本的外顯子20 T790M突變陽性率為2.7%（8/299），腫瘤細(xì)胞比例≤30%組的陽性率為1.5%（1/68），＞30%組的陽性率為3.0%（7/231），兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.688）。

表2 癌細(xì)胞數(shù)量與EGFR基因突變率的關(guān)系Tab 2 Relationship between the number of tumor cells and EGFR gene mutation rate

表3 DNA濃度與EGFR基因突變率的關(guān)系Tab 3 Relationship between DNA concentration and EGFR gene mutation rate

表4 癌細(xì)胞比例與EGFR基因突變率的關(guān)系Tab 4 Relationship between the tumor cell propotion and mutation rate of EGFR gene

2.5 單因素及多因素Logistic回歸分析 單因素Logistic分析表明，男性（OR=3.655,95%CI:2.225‐6.006,P＜0.001）、有吸煙史（OR=4.125,95%CI:2.522‐6.742,P＜0.001）、TTF‐1陰性（OR=10.462,95%CI:2.413‐45.351,P=0.002）及腫瘤細(xì)胞比例≤30%（OR=2.119,95%CI:1.182‐3.797,P=0.001）均與低突變檢出率有關(guān)。多因素Logistic分析表明，男性（OR=2.323,95%CI:1.266‐4.263,P＜0.001）、有吸煙史（OR=3.252,95%CI:1.831‐5.777,P＜0.001）、TTF‐1陰性（OR=7.914,95%CI:1.789‐35.015,P=0.006）及腫瘤細(xì)胞比例＜30%（OR=2.134,95%CI:1.045‐4.358,P=0.038）是與低突變檢出率有關(guān)的主要因素。

表5 多因素Logistic回歸分析各因素對(duì)EGFR基因突變檢出率的影響Tab 5 Analyzing the influence of various factors on EGFR gene mutation detection rate with multivariate Logistic regression

3 討論

隨著分子醫(yī)學(xué)和靶向藥物研究的發(fā)展，肺癌的治療已經(jīng)進(jìn)入到個(gè)體化治療的階段。伴有EGFR基因突變的不可手術(shù)晚期非小細(xì)胞肺癌患者接受TKI靶向藥物治療，其療效顯著優(yōu)于含鉑化療，能較大程度改善患者的生活質(zhì)量。準(zhǔn)確地檢測出EGFR基因突變型是選擇合適靶向藥物的重要前提，而標(biāo)本的質(zhì)量顯著影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，標(biāo)本質(zhì)量不佳是造成假陰性結(jié)果的主要原因，因此在檢測前對(duì)標(biāo)本進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估能有效避免這種現(xiàn)象的出現(xiàn)，從而獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，使患者最大程度受益。本次分析設(shè)定了3個(gè)標(biāo)本質(zhì)量評(píng)估指標(biāo)，分別為標(biāo)本提取的基因組DNA濃度、對(duì)應(yīng)切片的腫瘤細(xì)胞數(shù)量以及腫瘤細(xì)胞比例。我們的分析結(jié)果顯示DNA濃度≤20.4 ng/μL組及＞20.4 ng/μL組的陽性率之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（42.7% vs 44.3%）。有研究[10]數(shù)據(jù)顯示基因突變陽性組和陰性組的DNA濃度平均值及95%CI之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。我們認(rèn)為樣本提取的DNA濃度在高于2 ng/μL達(dá)到合格水平后，DNA濃度的高低不再影響EGFR基因突變陽性率。在我們的分析中，在腫瘤細(xì)胞數(shù)＞200的前提下，腫瘤細(xì)胞數(shù)≤500組（40.7%）與＞500組（43.8%）的陽性率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明腫瘤細(xì)胞數(shù)＞200之后，腫瘤細(xì)胞總數(shù)與陽性率無明顯相關(guān)性。有研究[11]的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示突變陽性組和陰性組的腫瘤細(xì)胞數(shù)中位數(shù)之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.172）。因此，只要不低于一個(gè)特定的下限值（與檢測方法有關(guān)），腫瘤細(xì)胞數(shù)量并不影響陽性率，本研究的結(jié)論與此一致。文獻(xiàn)報(bào)道及我們的結(jié)果均表明石蠟切片的腫瘤細(xì)胞數(shù)量及其提取的DNA濃度都不是影響陽性率的主要因素，但我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞比例≤30%組和＞30%組檢出率分別為29.4%、47.6%，腫瘤細(xì)胞比例與陽性率存在明顯相關(guān)性。

靈敏度不同的檢測方法要求的腫瘤細(xì)胞比例的最小檢測閾值是不相同的。直接測序法要求組織切片腫瘤細(xì)胞比例需達(dá)到30%‐50%[12]；低溫變性共擴(kuò)增法（co‐amplification at lower denaturation temperature‐polymerase chain reaction,COLD‐PCR）要求的檢測閾值是30%[13]，而靈敏度更高的是突變擴(kuò)增系統(tǒng)（amplification refractory mutation system,ARMS），ARMS法作為一種基于突變等位基因優(yōu)先擴(kuò)增的高靈敏度檢測方法，其原理是特異性引物與突變DNA模板互補(bǔ)結(jié)合擴(kuò)增，而野生型模板則不能與引物成功配對(duì)。但是當(dāng)標(biāo)本腫瘤細(xì)胞比例過低時(shí)，大量野生型DNA的存在可能會(huì)影響突變DNA模板與特異性引物的結(jié)合導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。該法要求腫瘤細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量＞200個(gè)，腫瘤細(xì)胞比例＞10%就能成功檢測出突變，這種高靈敏度的方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床對(duì)肺癌患者的EGFR基因突變檢測。本次分析采用的即為這種檢測方法，我們病例標(biāo)本檢測前評(píng)估的腫瘤細(xì)胞數(shù)和比例都達(dá)到檢測平臺(tái)的要求，但是有一部分腫瘤細(xì)胞比例在10%‐30%之間的病例，其EGFR突變的檢出率較低。我們認(rèn)為造成這種現(xiàn)象有兩個(gè)原因：①評(píng)估人員的主觀性，根據(jù)文獻(xiàn)[14,15]報(bào)道，發(fā)現(xiàn)病理醫(yī)生視覺評(píng)估的腫瘤細(xì)胞比例會(huì)比使用掃描鏡系統(tǒng)計(jì)算的比例高10%‐20%；②連續(xù)切片會(huì)導(dǎo)致腫瘤組織的損耗，用于評(píng)估腫瘤細(xì)胞數(shù)量和比例的切片來自于切取分子檢測的切片前的切片，后續(xù)的連續(xù)切片會(huì)導(dǎo)致腫瘤組織的損耗，因此實(shí)際用于EGFR基因突變檢測的切片腫瘤細(xì)胞比例可能會(huì)比檢測前鏡下評(píng)估的切片比例低。這可能是造成腫瘤細(xì)胞比例鏡下評(píng)估值在10%‐30%的標(biāo)本其突變檢出率較低的另一個(gè)原因。為了提高EGFR基因突變檢出率，我們最好對(duì)分子檢測切片前后的HE切片均進(jìn)行標(biāo)本質(zhì)量的評(píng)估，這樣才能真實(shí)反映分子檢測標(biāo)本的腫瘤細(xì)胞數(shù)和比例。另外，當(dāng)標(biāo)本腫瘤細(xì)胞比例低時(shí)，有必要通過顯微切割等方法富集腫瘤細(xì)胞，提高腫瘤細(xì)胞比例以達(dá)到檢測閾值[16]。

近年來，下一代測序（next‐generation sequencing,NGS）已廣泛用于臨床分子檢測。與傳統(tǒng)方法相比，這種新技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是能夠在一次檢測中檢測到多種基因改變及伴隨突變，且能定量檢測突變等位基因頻率[17]。NGS分析靈敏度為腫瘤細(xì)胞比例的5%‐10%[18]，一般建議將送檢閾值定為靈敏度的2倍以上[19]，部分研究采用的送檢閾值為10%[20]，而部分研究為20%[18,21,22]，其中存在10%的差異。鑒于我們發(fā)現(xiàn)ARMS法腫瘤細(xì)胞比例范圍在10%‐30%的標(biāo)本陽性率低于腫瘤細(xì)胞比例＞30%組，我們推測使用NGS進(jìn)行檢測的標(biāo)本也有可能也會(huì)存在類似情況，腫瘤細(xì)胞比例范圍在臨界狀態(tài)（10%‐20%）的樣本可能也會(huì)存在部分假陰性情況。目前只有一項(xiàng)研究對(duì)比了肺腺癌腫瘤細(xì)胞比例10%‐20%的樣本與＞20%的標(biāo)本使用NGS方法檢測突變的陽性率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR和鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten ratsarcoma viral oncogene,KRAS）基因的檢出率在兩者中無明顯差異，但腫瘤細(xì)胞比例10%‐20%組的HER2/BRAF/PIK3CA和獲得性EGFR T790M突變的檢出率低于腫瘤細(xì)胞比例＞20%組[23]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞比例≤30%組T790M突變陽性率低于腫瘤細(xì)胞比例＞30%組，但是可能腫瘤細(xì)胞比例≤30%組樣本量不夠大，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.688）。關(guān)于腫瘤細(xì)胞比例范圍在10%‐20%這類臨界狀態(tài)的標(biāo)本使用NGS方法得出的陰性結(jié)果是否可信、EGFR及其他驅(qū)動(dòng)基因檢出率是否也會(huì)受腫瘤細(xì)胞比例低的影響、是否需要將送檢閾值提高等問題值得進(jìn)一步研究。而對(duì)于部分石蠟組織腫瘤細(xì)胞比例低、無法進(jìn)行富集而再次活檢取材風(fēng)險(xiǎn)大的患者，血液中的循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）是一種常用的突變檢測腫瘤DNA替代來源。目前檢測ctDNA的方法并未標(biāo)準(zhǔn)化，幾項(xiàng)研究得出的ctDNA檢測敏感性范圍在66%‐78%[24‐27]，與石蠟組織的敏感性相比較低。但液體活檢取材無侵入性創(chuàng)傷且操作簡便，可與石蠟組織相結(jié)合診斷。當(dāng)檢測標(biāo)本石蠟組織腫瘤細(xì)胞比例低于30%懷疑結(jié)果為假陰性時(shí)，可補(bǔ)充行ctDNA檢測，若檢測結(jié)果為陽性可避免二次活檢帶來的風(fēng)險(xiǎn)，若結(jié)果仍為陰性才需考慮再次活檢獲取足夠的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行分子檢測。

本研究結(jié)果表明，在達(dá)到檢測的最低要求后，DNA濃度和腫瘤細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量并不影響EGFR基因突變檢出率，但是低腫瘤細(xì)胞比例仍可影響EGFR基因突變檢出率。因此，基因檢測切片后，有必要再次評(píng)估最后一張切片以得出準(zhǔn)確的送檢標(biāo)本腫瘤細(xì)胞比例。對(duì)于比例較低的標(biāo)本有必要通過顯微切割等方法富集腫瘤細(xì)胞，避免比例低導(dǎo)致假陰性結(jié)果。對(duì)于無法進(jìn)行腫瘤細(xì)胞富集的標(biāo)本，可行ctDNA檢測作為補(bǔ)充，若結(jié)果仍為陰性才需考慮再次活檢獲取足夠的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行分子檢測。

Author contributions

Jiang JH conceived and designed the study.Li YQ performed the experiments.Li YQ analyzed the data.Gu YY contributed analysis tools.Jiang JH and Gu YY provided critical inputs on design,analysis,and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted