白俊 胡雅瓊 陳新璐 陳琳 張麗萍 尹崇高 李洪利

在全人類中，肺癌仍然是最常見的死亡原因[1]。其中非小細胞肺癌（non‐small cell lung cancer,NSCLC）約占肺癌的85%，肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）占NSCLC的60%[2]。目前雖然新技術(shù)和新療法在早期診斷中取得了進步，但LUAD患者的5年總生存率仍然很低[3]。因此，深入分析LUAD的轉(zhuǎn)移機制具有重要意義。

MicroRNAs（miRNAs）通過互補作用負向調(diào)控基因表達，與靶基因mRNA的3'‐非翻譯區(qū)（3'‐UTR）特異性結(jié)合[4]。miRNA與細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種細胞和生理過程相關(guān)，且其異常表達與多種人類腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[5]。有研究[6]顯示miR‐144‐3p可抑制胃癌細胞進展，其表達水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤原發(fā)灶‐淋巴結(jié)‐轉(zhuǎn)移（tumor‐node‐metastasis,TNM）分期和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1,IRS1）是一種潛在致癌基因，參與膠質(zhì)母細胞瘤、骨肉瘤的相關(guān)調(diào)控進展[7,8]。有研究[9]表明，miR‐144通過靶向IRS1在喉鱗癌中起到抑癌作用。但是，關(guān)于miR‐144‐3p靶向IRS1的調(diào)控LUAD機制仍有待研究。因此本研究將探討miR‐144‐3p是否可以通過靶向調(diào)控IRS1影響LUAD的侵襲和轉(zhuǎn)移，以期為LUAD治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 細胞株：人正常肺上皮細胞BEAS‐2B和肺腺癌NCI‐H1299、A549細胞均購自ATCC，并通過STR細胞鑒定。miR‐144‐3p引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成。雙熒光素酶報告基因載體、質(zhì)粒等均由吉凱基因構(gòu)建合成。Lipofectamine2000購于Invitrogen公司，8 μm孔徑Transwell小室購自BD Biosciences。IRS1抗體為兔抗IRS1抗體（ab40777），β‐actin抗體為兔抗β‐actin抗體（ab8227），抗體均購自Abcam公司。

1.2 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫 GEO數(shù)據(jù)庫：從基因表達譜GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）中下載肺腺癌患者資料。GSE51853數(shù)據(jù)集為5例正常組織與76例肺腺癌組織miRNA表達譜。Kaplan‐Meier Plotter（Kmplot）網(wǎng)站（https://kmplot.com/analysis/）能夠評估21種癌癥類型中54,000基因?qū)ι媛实挠绊?。Starbase數(shù)據(jù)庫（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）提供了miRNA和各種RNA分子的相互作用信息，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了ceRNA網(wǎng)絡(luò)。使用在線預(yù)測網(wǎng)站miRWalk（http://mirwalk.umm.uni‐heidelberg.de/）、TargetScan（http://www.targetscan.org/）和miRDB（http://mirdb.org/miRDB/）預(yù)測miRNA的靶基因。使用STRING在線網(wǎng)站（https://string‐db.org/）構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，導(dǎo)入Cytoscape3.7.1刪除獨立節(jié)點，對蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖進行分析，它主要是通過節(jié)點、邊緣、度和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)來測量網(wǎng)絡(luò)，因此它可以幫助識別關(guān)鍵基因和關(guān)鍵蛋白質(zhì)群落。

1.3 細胞培養(yǎng)與分組 常溫復(fù)蘇正常肺上皮細胞BEAS‐2B，肺腺癌細胞NCI‐H1299和A549于37oC、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其生長至對數(shù)期，鋪于六孔板中進行轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒由上海吉凱生物有限公司構(gòu)建。將細胞分組：①con組：將過表達miR‐144對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入A549細胞；②miR‐144組：轉(zhuǎn)入miR‐144過表達質(zhì)粒；③A549/miR‐144+NC組：同時轉(zhuǎn)入miR‐144過表達質(zhì)粒和IRS1過表達對照質(zhì)粒；④A549/miR‐144+IRS1組：同時轉(zhuǎn)入miR‐144過表達質(zhì)粒和IRS1過表達質(zhì)粒。

1.4 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT‐PCR）實驗 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄過程參考本課題先前已發(fā)表文獻[4]。反應(yīng)條件為95oC 5 s、63oC 30 s、72oC 30 s進行35個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參。miR‐144‐3p的上游引物為3'‐GCGCGCGTACAGTAT AGATGA‐5'，下游引物為5'‐AGTGCAGGGTCCGAGGTAT T‐3'，莖環(huán)結(jié)構(gòu)為5'‐GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACAGTACA‐3'。

1.5 Transwell遷移侵襲實驗 Transwell實驗分析A549細胞的遷移和侵襲能力。將150 μL轉(zhuǎn)染的A549細胞（4×104個）懸液接種在含1%胎牛血清的培養(yǎng)基于上室；同時，將含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基（500 μL）加入下室。與遷移實驗不同的是，在侵襲實驗中使用的Transwell小室涂有基質(zhì)膠。24 h后，甲醇固定后用Giemsa染色，在顯微鏡下觀察計數(shù)，所有實驗均重復(fù)3次。

1.6 CCK8細胞增殖實驗 收集各組細胞，將細胞懸液接種到96孔板中，每孔約100 μL、2×103個細胞，培養(yǎng)24 h后每孔加入含10%CCK8的培養(yǎng)基10 μL，培養(yǎng)1 h后，測定吸光度值A(chǔ)450 nm，分別檢測轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h、96 h后的細胞吸光度值A(chǔ)450 nm。獨立重復(fù)實驗3次。

1.7 Western blot實驗 轉(zhuǎn)染后的A549細胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，進行分離膠濃度為12%的SDS‐PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4oC孵育過夜，在1:5,000稀釋的HRP二抗中孵育1 h，ECL曝光。一抗稀釋度：IRS1為1:1,000、β‐actin為1:1,000。

1.8 雙熒光素酶實驗 293T細胞購自ATCC，細胞培養(yǎng)方式按照ATCC建議。構(gòu)建pGL3‐IRS1‐3'‐UTR‐MUT和pGL3‐IRS1‐3'‐UTR‐WT質(zhì)粒，將293T細胞培養(yǎng)于24孔板中，100 ng的pGL3‐IRS1‐3'‐UTR‐MUT和pGL3‐IRS1‐3'‐UTR‐WT使用Lipofectamine2000（Invitrogen,12566014）和miRNA對照及過表達載體分別共轉(zhuǎn)染293T細胞。培養(yǎng)48 h，用螢火蟲熒光值和海腎熒光值的比值計算熒光素酶報告基因的活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差（Mean±SD），兩組計量資料采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR‐144‐3p在肺腺癌組織中表達降低以及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析 通過對GEO2R分析并獲取數(shù)據(jù)集GSE51853，篩選條件為logFC＜‐1（P＜0.05）結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR‐144‐3p在GSE51853數(shù)據(jù)集中的表達下調(diào)且P值最??；顯示miR‐144‐3p在LUAD組織中表達降低，且差異顯著（圖1A、圖1B）。此外Starbase數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，miR‐144‐3p在LUAD患者組織中的表達較正常肺腺組織降低（圖1C）。我們用mirTarPathway對miR‐144‐3p進行KEGG通路分析，以明確miR‐144‐3p在各種通路的富集情況，從而對其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的機制進行初步預(yù)測。結(jié)果顯示，miR‐144‐3p在p53信號通路以及TGF‐beta信號通路產(chǎn)生富集，這些通路在癌癥中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[10]，因此我們可以推測miR‐144‐3p也許通過參與相關(guān)通路的調(diào)控從而影響肺腺癌的進展（圖1D）。

圖1 miR-144-3p在LUAD患者組織中的表達量和miR-144-3p的KEGG通路分析。A：火山圖顯示miR-144-3p在數(shù)據(jù)集GSE51853的表達差異；B：miR-144-3p在正常和肺腺癌組織中的表達情況；C：Starbase查詢miR-144-3p的表達情況；D：KEGG通路分析miR-144-3p的富集情況。Fig 1 Expression of miR-144-3p in lung adenocarcinoma tissue and its KEGG pathway analysis.A:Volcano plot of GSE51853 showing miRNA expression in lung adenocarcinoma tissues and normal tissues; B:The expression of miR-144-3p in normal tissues and cancer tissues; C:Starbase queries the expression of miR-144-3p; D:KEGG pathway analysis the enrichment of miR-144-3p.LUAD:lung adenocarcinoma; TGF:transforming growth factor; KEGG:Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.****P＜0.0001.

2.2 miR‐144‐3p在肺腺癌細胞中低表達 qRT‐PCR檢測結(jié)果顯示：BEAS‐2B、H1299、A549細胞株中miR‐144‐3p相對表達量分別為1.00±0.00、0.75±0.05、0.54±0.03，因此選取A549細胞進行后續(xù)研究（P＜0.05，圖2A）。qRT‐PCR檢測轉(zhuǎn)染miR‐144過表達質(zhì)粒A549/miR‐144后miR‐144‐3p的表達情況，結(jié)果顯示與A549/con組（1.00±0.00）相比，A549/miR‐144組中的miR‐144‐3p（2.70±0.06）表達水平顯著增高（P＜0.05，圖2B），提示轉(zhuǎn)染成功。

圖2 miR-144-3p在各組細胞中的表達量。A：qRT-PCR驗證miR-144-3p在不同細胞系的表達情況（**P＜0.01，***P＜0.001）；B：qRT-PCR驗證miR-144-3p的轉(zhuǎn)染效率。Fig 2 Expression of miR-144-3p in different cells.A:qRT-PCR verifies the expression of miR-144-3p in different cell lines (**P＜0.01,***P＜0.001); B:qRT-PCR verifies the transfection efficiency of miR-144-3p (*P＜0.05).qRT-PCR:quantitative reverse transcription polymerase chain reaction.

2.3 過表達miR‐144抑制肺腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移和增殖能力Transwell遷移實驗顯示，A549/miR‐144組細胞穿過下室的細胞數(shù)（169.33±4.04）比A549/con組細胞數(shù)（240.00±21.17）明顯減少（P＜0.05)；侵襲實驗結(jié)果顯示，A549/miR‐144組細胞穿過基底膜的細胞數(shù)（155.33 ±5.03）比A549/con組細胞數(shù)（205.00±5.00）明顯減少（P＜0.05）（圖3A、圖3B），結(jié)果證明過表達miR‐144可以抑制肺腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。通過CCK8細胞增殖實驗檢測各組細胞的增殖能力，結(jié)果顯示，與對照組在72 h（0.65±0.05）、96 h（0.96±0.02）的增殖能力相比，過表達miR‐144組在72 h（0.43±0.07）、96 h（0.67±0.06）的增殖能力明顯降低。

圖3 過表達miR-144抑制A549細胞的遷移侵襲和增殖能力。A：Transwell實驗驗證各組細胞的遷移和侵襲能力；B:Transwell實驗檢測各組細胞的統(tǒng)計學(xué)分析（*P＜0.05）；C：CCK8細胞增殖實驗檢測各組細胞的增殖能力（*P＜0.05）。Fig 3 Overexpression of miR-144 inhibits the migration and invasion and proliferation ability of of each group.A:Transwell assay verified the ability of cell migration and invasion in each group; B:Transwell assay was used to detect the statistical analysis of cells in each group (*P＜0.05); C:CCK8 cell proliferation assay was used to detect the proliferation ability of each group (*P＜0.05).OD:optical density.

2.4 IRS1為miR‐144‐3p的Hub基因 利用預(yù)測軟件miRDB、miRWalk、TargetScan預(yù)測miR‐144‐3p的靶基因，交集得到122個靶基因（圖4A）。我們使用STRING分析miR‐144‐3p靶基因間的蛋白相互作用關(guān)系，并構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)基因間的相互作用強度及置信度運用Cytoscape繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)并進行篩選。結(jié)果顯示，degree值的前十位基因為（TJP1、ZEB2、FMR1、FN1、ZEB1、GRM5、CREB1、PBRM1、IRS1、SMARCA4）（圖4B、圖4C），其中顏色由藍色到橘色，表示degree值由小到大，并且degree值越高，節(jié)點的大小越大，結(jié)合分數(shù)越高，邊的寬度越寬。GEDs在線數(shù)據(jù)庫查詢IRS1在癌癥中的表達情況，與正常組織相比，IRS1在LUAD中表達升高（圖4D），且高表達水平的IRS1與患者不良預(yù)后相關(guān)（P=0.018，圖4E）。因此我們選定IRS1進行下一步研究。

圖4 miR-144-3p的Hub基因篩選。A：基因預(yù)測維恩圖；B：PPI互作網(wǎng)絡(luò)；C：Cytoscape檢測靶向基因的樞紐基因；D：IRS1在正常組織和肺腺癌組織中的表達；E：IRS1的生存曲線分析。Fig 4 Hub gene screening of miR-144-3p.A:The venn plot of predicted genes; B:PPI interaction network; C:The Hub genes of targeted genes made by Cytoscape; D:IRS1 expression in normal lung adenocarcinoma tissues and lung adenocarcinoma tissues; E:Survival analysis of of IRS1(P=0.018).PPI:protein protein interaction.

2.5 miR‐144‐3p通過靶向調(diào)控IRS1抑制LUAD細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力 通過雙熒光素酶實驗檢測，將miR‐144質(zhì)粒與pGL3‐IRS1‐3'‐UTR‐WT報告載體共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性降低（P＜0.05）；而將miR‐144質(zhì)粒與pGL3‐IRS1‐3'‐UTR‐MUT報告載體共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性無明顯變化（圖5A）。結(jié)果表明IRS1 mRNA的3'‐UTR是miR‐144的直接結(jié)合位點。Western blot實驗顯示，IRS1在A549細胞（1.64±0.10）中的表達明顯高于BEAS‐2B（1.00±0.04）（P＜0.05，圖5B），在A549/miR‐144組細胞中的IRS1蛋白表達（0.62±0.03）明顯比A549/con組細胞的（1.00±0.12）低（P＜0.05，圖5C）。Transwell遷移實驗結(jié)果顯示miR‐144+IRS1組穿過基底膜的細胞數(shù)（313.33±10.41）比miR‐144+NC組細胞數(shù)明顯增多（133.33±7.64），侵襲實驗結(jié)果顯示miR‐144+IRS1組穿過基底膜的細胞數(shù)（224.67±9.61）比miR‐144+NC組細胞數(shù)明顯增多（113.67±7.09）且差異顯著（P＜0.05，圖5D）。結(jié)果表明，IRS1 mRNA的3'‐UTR是miR‐144的直接結(jié)合位點，且miR‐144可以通過靶向調(diào)控IRS1抑制LUAD細胞的遷移和侵襲能力。

圖5 miR-144靶向調(diào)控IRS1抑制肺腺癌細胞的遷移和侵襲能力。A：熒光素酶實驗檢測不同組細胞的熒光素酶活性；B：Western blot驗證IRS1的表達；C：Western blot檢測過表達miR-144后IRS1的表達情況；D：Transwell實驗檢測不同組細胞的遷移和侵襲能力。Fig 5 miR-144 inhibits the invasion and migration ability of lung adenocarcinoma cancer by targeting the regulation of IRS1.A:Luciferase activity of cells in different group was detected by luciferase experiment; B:Western blot to verify IRS1 expression; C:Western blot to detect the expression of IRS1 after overexpression of miR-144; D:Transwell experiment detects the migration and invasion ability of different groups of cells.NS：no significance.

3 討論

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移在肺癌最初診斷時經(jīng)常見到，是肺癌相關(guān)死亡的主要原因[11]。目前已經(jīng)報道了許多關(guān)于miRNA對肺癌的調(diào)節(jié)，例如，miR‐193阻止NSCLC的侵襲和遷移[12]。miR‐454作為一種預(yù)后因素，對肺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移做出了貢獻[13]。關(guān)于人類癌癥的研究，miR‐144的異常下調(diào)已在多種人類惡性腫瘤中被證實，包括膽管癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌和甲狀腺癌[14]。

IRS1是一種潛在的致癌基因，與多種惡性腫瘤有關(guān)[15]。在功能上，IRS1不僅誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生，而且是多種致癌途徑的樞紐。研究表明，IRS1可能作為癌基因參與癌細胞的生長、增殖、遷移、侵襲和分化[16]，并且在胰腺癌[17]、結(jié)直腸癌[18]、膠質(zhì)母細胞瘤[19]中高表達。IRS1異常表達與預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高和惡性腫瘤的生存率相關(guān)，我們當前的目的是揭示IRS1在LUAD中發(fā)揮作用的機制[20]。

有證據(jù)[21]表明miR‐144還可以通過靶向ZFX抑制肝癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。miR‐144通過靶向TIGAR抑制細胞增殖，促進肺癌細胞凋亡和自噬[22]。LUAD復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在機制尚不清楚。本次實驗研究了microRNA‐144‐3p（miR‐144‐3p）在LUAD發(fā)生和進展中的作用。通過由GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE51853數(shù)據(jù)集，篩選得到了與LUAD相關(guān)的miR‐144‐3p，生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫顯示miR‐144‐3p在LUAD中表達降低，KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)miR‐144‐3p與癌癥通路相關(guān)。qRT‐PCR檢測miR‐144‐3p在肺腺癌細胞中的表達情況。在體外，miR‐144‐3p上調(diào)降低細胞存活率和遷移率，反之亦然。有研究[23]表明，XIST通過抑制miR‐144調(diào)控IRS1的表達和PI3K/AKT信號通路促進喉鱗癌的進展。本研究通過PPI和CytoHubba識別候選基因，最終選取IRS1作為研究對象。另外GEDS數(shù)據(jù)庫以及Kmplot數(shù)據(jù)庫分析了IRS1在正常與癌癥組織中的表達，生存分析以及靶向結(jié)合情況。在機制上，miR‐144‐3p能夠負調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)移蛋白IRS1。我們的結(jié)果支持miR‐144‐3p通過靶向IRS1參與LUAD的進展，因而它有可能成為LUAD潛在的生物標志物和治療靶點，后續(xù)我們的實驗將繼續(xù)研究miR‐144‐3p在相關(guān)信號通路中的作用。

綜上所述，miR‐144‐3p與靶基因IRS1很有可能參與LUAD的發(fā)生發(fā)展過程，這對完善miR‐144‐3p與LUAD的關(guān)系提供了參考資料。對開拓miR‐144‐3p在LUAD中的研究提供了新的方向。

Author contributions

Bai J,Hu YQ and Chen XL conceived and designed the study.Bai J and Hu YQ performed the experiments.Chen L and Zhang LP analyzed the data.Yin CG and Li HL contributed analysis tools.Yin CG and Li HL provided critical inputs on design,analysis,and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript assubmitted.