李霞飛，李自良，賈夢夢，陳云瑞，向 導(dǎo)，張旺鋒，張亞黎

(1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003；2.新疆烏蘭烏蘇農(nóng)業(yè)氣象試驗(yàn)站/烏蘭烏蘇國家綜合氣象觀測專項(xiàng)試驗(yàn)外場，新疆烏蘭烏蘇 832199)

0 引 言

【研究意義】花青素主要通過過濾、衰減和反射高強(qiáng)度的藍(lán)紫光從而調(diào)節(jié)對光能的吸收[1]，陳靜等[2]研究低溫弱光下光化學(xué)能力降低導(dǎo)致過量激發(fā)能的積累，而花青素的存在能夠維持一定的光合能力?；ㄇ嗨氐拇嬖谀軌驕p少PSII中的過剩激發(fā)能，有效保護(hù)PSII的光合活性[3-4]；薛占軍等[5]研究花青素通過吸收400～600 nm的可見光，有效保護(hù)PSI的活性。張開明等[6]研究發(fā)現(xiàn)，含有花青素的紅葉光合速率較低，主要是由于花青素限制了葉綠體對光能的吸收，影響光反應(yīng)中心的開放從而影響碳同化過程，花青素與植物光合作用有密切聯(lián)系[7]。分析含有花青素的棉花光合參數(shù)的變化，對研究花青素作為光保護(hù)機(jī)制的研究有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物生育進(jìn)程中常出現(xiàn)各種逆境脅迫，將導(dǎo)致光合器官吸收的光能不能全部用來進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)，過剩的光能會產(chǎn)生大量活性氧自由基，破壞植物光合機(jī)構(gòu)，影響光合作用的穩(wěn)定運(yùn)行[8]。為了防止光損傷的發(fā)生，植物激發(fā)了各種光保護(hù)機(jī)制來減少過剩激發(fā)能的積累，包括葉片運(yùn)動[9]、以無害熱量形式散失的熱耗散[10]、通過光化學(xué)途徑產(chǎn)生能量物質(zhì)促進(jìn)D1蛋白的合成，修復(fù)光反應(yīng)中心[11-12]，以及圍繞PSI的環(huán)式電子傳遞[13-14]?；ㄇ嗨匾部梢宰鳛橐环N光保護(hù)機(jī)制維持光合機(jī)構(gòu)的穩(wěn)定運(yùn)行[15]。依賴葉黃素循環(huán)的熱耗散[16-18]是保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免受損傷的重要的光保護(hù)機(jī)制，類黃酮類物質(zhì)在長期的光保護(hù)過程中比葉黃素循環(huán)更為重要[19]，但也有研究表明花青素并不具有光保護(hù)作用[20]。【本研究切入點(diǎn)】花青素可以作為一種光保護(hù)機(jī)制保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免受損傷。有關(guān)花青素和其他光保護(hù)機(jī)制環(huán)式電子流和葉黃素循環(huán)的熱耗散之間關(guān)系的研究較少。以不同花青素含量的棉花為材料，研究花青素含量的差異對其光合性能的影響以及為維持光合機(jī)構(gòu)運(yùn)行所啟動的光保護(hù)機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析花青素含量差異與光保護(hù)機(jī)制的關(guān)系，為棉花的高光效育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)于2018年在新疆中國氣象站烏蘭烏蘇生態(tài)與農(nóng)業(yè)氣象站(44°17’N，86°03’E)進(jìn)行。供試材料由國家棉花種質(zhì)資源中期庫(National Medium-term Gene Bank of Cotton in China)和國家棉花種質(zhì)資源平臺(National cotton germplasm resources platform)提供。圖1，表1

圖1 供試材料

表1 供試材料編號及名稱

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

小區(qū)面積4.5 m2，隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)3次。4月22日布滴灌帶，鋪膜后人工點(diǎn)播，2 d后進(jìn)行少量灌溉，保證出苗。寬窄行種植，株距12 cm，密度為22×104株/hm2，其他管理措施同一般大田管理。

待棉花進(jìn)入盛花期，葉片顏色均勻一致，取主莖上倒數(shù)第1片完全展開葉，每個(gè)材料取3次重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 指標(biāo)測定

1.2.2.1 葉綠素

將取回的棉花葉片用打孔器(孔徑5 mm)打成小圓片4個(gè)，放入 5 mL離心管，用約4 mL 80%的丙酮溶液浸提，置于完全遮光處浸提，定時(shí)振蕩至圓片完全褪綠。取其上清液用分光光度計(jì)UV-2041 型分光光度計(jì)(日本島津)比色，葉綠素含量的計(jì)算公式參考Lichtenthaler[21]。

1.2.2.2 花青素

選顏色均勻的棉花葉片，在葉脈兩側(cè)用5 mm打孔器取15個(gè)葉圓片，用15 mL 1%鹽酸甲醇溶液提取，在黑暗環(huán)境中浸提24～48 h，25 mL容量瓶定容，1%鹽酸甲醇溶液為空白對照。在波長530和652 nm處測其吸光度?；ㄇ嗨睾炕ㄇ嗨?Ant)=A550-0.25A652[22]。

1.2.2.3 光合參數(shù)

Li-6400便攜式光合測定系統(tǒng)(Li-COR，USA)測定光合氣體參數(shù)凈光合速率(Pn)。測定時(shí)，設(shè)置光強(qiáng) 2 000 μmol/(m2·s)、CO2濃度(400±2) μmol/(m2·s)、氣體流量300 μmol/s，葉片溫度(30±2)℃，參比室的水分(20±2) μmol/(m2·s)。將棉花葉片左上部加入葉室，待數(shù)據(jù)穩(wěn)定后，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2.4 吸光系數(shù)

用Imaging-PAM熒光成像儀(Walz，德國)測定吸光系數(shù)。首先校準(zhǔn)儀器，然后將被測材料放置到成像區(qū)域，用樣品架上的細(xì)線固定材料，在材料中上部葉脈兩側(cè)選擇5～6個(gè)區(qū)域，測定吸光系數(shù)(Abs)。

1.2.2.5 NDH活性

利用Dual-PAM-100葉綠素?zé)晒鈨x(Walz，德國)測量NDH活性和P700暗還原速率。將取回的棉花材料放置在室溫條件下進(jìn)行0.5～1 h黑暗適應(yīng)，打開光化光AL(1 828 μmol/(m2·s))進(jìn)行熒光誘導(dǎo)，待熒光信號趨于平緩狀態(tài)(大概4 min左右)，關(guān)掉光化光熒光信號先下降后立即上升，熒光信號立即上升速率能夠反映NDH介導(dǎo)的環(huán)式電子活性[23]。

1.2.2.6 P515吸收變化

單周轉(zhuǎn)飽和閃光誘導(dǎo)活體棉花葉片的P515快速馳豫動力學(xué)可以反映類囊體膜的完整性和ATP合成酶活性[24]。經(jīng)過1 h暗適應(yīng)后，P515吸收信號先快速上升，緩慢上升，達(dá)到峰值后，緩慢下降。先打開光化光(1 800 μmol/(m2·s))照光10 min，后暗適應(yīng)4 min，P515吸收信號先快速上升后快速下降，緩慢上升相消失。暗適應(yīng)后P515吸收信號緩慢下降，膜的完整性，照光后P515吸收信號快速下降的初始斜率可以用來表示ATP酶活性[25]。

利用Dual-PAM-100(Walz，Germany)的新模塊P515/535 檢測雙波長550～515差示吸收的信號變化。將供試材料充分暗適應(yīng)(至少1 h)，測定的515信號能夠反映類囊體膜的完整性[24]，然后打開光化光(1 828 μmol/(m2·s))誘導(dǎo)棉花葉片10 min，關(guān)掉光化光黑暗處理4 min，再測定P515信號吸收變化能夠反映ATP合成酶活性[25]。

測定550～515 nm信號的暗-光-暗誘導(dǎo)瞬變，取充分暗適應(yīng)幾個(gè)小時(shí)的棉花材料，打開光化光AL(1 828 μmol/(m2·s))誘導(dǎo)10 min后515信號趨于穩(wěn)定(玉米黃質(zhì)合成的測定)，然后關(guān)掉光化光AL，515信號先快速下降隨后上升逐漸趨于穩(wěn)定(跨類囊體膜質(zhì)子梯度的測定)[26-27]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，運(yùn)用Rstudio軟件進(jìn)行方差分析及作圖。試驗(yàn)處理間的多重比較采用“Agricolae”程序包進(jìn)行最小顯著差法(Least-significantdifference，LSD)分析，顯著水平為0.05，并用英文小寫字母標(biāo)記。圖表中的數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同棉花花青素含量的差異

研究表明，綠葉棉花無花青素的存在，而紅葉棉花有明顯花青素存在，隨顏色加深，花青素含量增多。低花青素含量的棉花Chla、Chlb、ChlT均較高花青含量的棉花低，而無花青素的棉花 Chla、Chlb、ChlT和高花青素含量棉花幾乎無差異，低花青素棉花類胡蘿卜素(Car)較高花青素棉花低，含花青素的棉花較無花青素的棉花低。圖2

圖2 不同棉花花青素含量和葉綠素含量的差異

2.2 不同花青素含量的棉花光合性能的差異

研究表明，含花青素和不含花青素的棉花Fv/Fm均無差異，各棉花可能均相應(yīng)啟動了光保護(hù)機(jī)制。含花青素的棉花Abs較不含花青素的棉花高，含花青素的棉花吸光系數(shù)(Abs)為0.87明顯高于較不含花青素的棉花0.83，低花青素棉花Abs 0.86和高花青素棉花0.87無差異；隨花青素含量增加，凈光合速率(Pn)從31.19到31.43無差異，而無花青素的棉花Pn 34.25顯著高于含花青素的棉花31.19。表2

表2 不同花青素含量的棉花氣體交換參數(shù)變化

2.3 不同花青素含量的棉花NDH介導(dǎo)的環(huán)式電子活性的差異

研究表明，隨花青素含量增加，熒光信號的快速上升速率顯著增強(qiáng)，而花青素含量較低的棉花和無花青素的棉花熒光信號的快速上升無明顯差異?；ㄇ嗨睾吭礁逳DH介導(dǎo)的環(huán)式電子活性越高，高花青素的棉花伴隨較強(qiáng)的NDH介導(dǎo)的環(huán)式電子流。圖3

A：葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線；B：作用光關(guān)閉后葉綠素?zé)晒獾乃矔r(shí)上升

2.4 不同花青素含量的棉花ATP合成酶活性的差異

研究表明，在Before AL條件下高花青素含量的棉花和無花青素的棉花515信號緩慢上升幾乎無差異，類囊體的完整性都相對較好；而After AL條件下高花青素含量的棉花515信號快速下降的初始斜率顯著高于無花青素的棉花。高花青素含量的棉花較無花青素的棉花有較高的ATP合成酶活性，能夠合成更多的ATP，而低花青素含量的棉花和無花青素的棉花有相同的趨勢。圖4

圖4 花青素含量的差異對單周轉(zhuǎn)飽和閃光誘導(dǎo)P515的吸收變化

2.5 不同花青素含量的棉花葉黃素循環(huán)的熱耗散的差異

研究表明，在515信號暗-光誘導(dǎo)下，無花青素的棉花515信號顯著較含花青素的棉花強(qiáng)，而低花青素含量的棉花較高花青素含量的棉花強(qiáng)，在含花青素的棉花中玉米黃質(zhì)的合成速率顯著較無花青素的棉花弱，隨花青素含量的增多，玉米黃質(zhì)的合成速率變慢，花青素的存在可能抑制了玉米黃質(zhì)的合成，并且隨花青素含量的增多，抑制作用越強(qiáng)。圖5

圖5 花青素含量的差異下550～515 nm信號的暗-光-暗誘導(dǎo)瞬變的影響誘導(dǎo)瞬變

3 討 論

3.1 花青素含量增多伴隨葉片光合能力的減弱

花青素可通過過濾、衰減和反射高強(qiáng)度的藍(lán)紫光從而來減少光能的吸收[15、27]，可以調(diào)節(jié)葉綠素對光量子的吸收[1]。而光合色素在植物光合作用中主要起對吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化光能的作用，其中Chlb具有捕獲和吸收光能的作用，而Chla能夠執(zhí)行能量轉(zhuǎn)換，類胡蘿卜素不僅可以作為輔助色素捕獲光能，也可以猝滅活性氧防止光合器官受損[28]。高花青素含量的棉花Chla、Chlb、ChlT、Car均低花青素含量的高，吸光系數(shù)之間無差異，而相對無花青素的棉花而言，高花青素含量的棉花Chla、Chlb、ChlT較低，吸光系數(shù)較高，Car較低。花青素含量越低，吸收、轉(zhuǎn)換光能的能力較弱，猝滅活性氧的能力也較弱，花青素含量的多少能夠影響植物對光能的吸收以及猝滅活性氧的能力。

分析凈光合速率，低花青素棉花的Pn與較高花青素棉花無差異，相對無花青素的棉花，有花青素的棉花Pn較弱，有花青素的存在并且隨著花青素含量逐漸增多，光合性能越弱，可能含有花青素的棉花吸收的光能被花青素吸收、過濾使得轉(zhuǎn)換為光化學(xué)的能量減弱，使得光合能力減弱。

3.2 隨花青素含量升高NDH介導(dǎo)的環(huán)式電子流及其調(diào)控能力逐漸增強(qiáng)

環(huán)式電子傳遞是植物體內(nèi)重要的光合電子傳遞途徑[13、29]，研究中，很明顯高花青素含量的棉花中NDH介導(dǎo)的環(huán)式電子活性顯著高于無花青素的棉花，ATP合成酶活性也較無花青素的棉花強(qiáng)；同時(shí)隨花青素含量的增加，Y(ND)逐漸增強(qiáng)，Y(NA)逐漸減弱，較強(qiáng)的環(huán)式電子能夠耗散受體側(cè)的電子，減少氧化態(tài)的P700，保護(hù)PSI免受光損傷，有效保護(hù)PSI的活性。進(jìn)一步分析高花青素含量的棉花ATP合成酶活性較低花青素含量的棉花強(qiáng)，并且高花青素含量的棉花能夠較好的保護(hù)PSII的活性。隨花青素含量的增加，棉花光合能力減弱，而吸光能力增強(qiáng)，將面臨較多的過剩激發(fā)能，花青素含量的增加伴隨環(huán)式電子流及其調(diào)控能力的增強(qiáng)，有效保護(hù)了PSI和PSII的活性。

3.3 花青素能夠起到耗散過剩光能保護(hù)光合機(jī)構(gòu)的作用

P515信號的暗-光-暗誘導(dǎo)瞬變曲線能夠反映玉米黃質(zhì)的合成速率和類囊體腔內(nèi)H+的積累程度[26]。515光-暗誘導(dǎo)下，515信號最低點(diǎn)和穩(wěn)態(tài)點(diǎn)之間的差值能夠反映ΔpH[27]，無花青素的棉花ΔpH明顯較含有花青素的棉花高，不含花青素條件下類囊體腔內(nèi)的H+濃度顯著較高。

分布在葉片上表皮的花青素能夠阻擋強(qiáng)光[30]，Gould等[31]發(fā)現(xiàn)含花青素的葉片在受到光損傷后能夠快速恢復(fù)；Neill和Gould的工作證實(shí)，花青素可以耗散過剩激發(fā)能減少活性氧的產(chǎn)生[32]。Hughes等[33]研究證實(shí)，紅葉樹種的葉黃素循環(huán)過程較弱，更多的依賴花青素的光保護(hù)作用。

研究中，含有花青素的棉花玉米黃質(zhì)的合成速率顯著低于無花青素的棉花，可能是紫黃質(zhì)轉(zhuǎn)化為玉米黃質(zhì)的過程受到了影響，跨類囊體膜質(zhì)子梯度(ΔpH)也顯著低于無花青素的棉花，也就是說質(zhì)子梯度驅(qū)動的葉黃素循環(huán)的熱耗散在含有花青素的棉花中較弱，可能含有花青素的棉花主要依賴花青素的光破壞防御功能保護(hù)其光合機(jī)構(gòu)免受光抑制。隨花青素含量的增加，玉米黃質(zhì)的合成速率減弱，花青素越多，葉黃素循環(huán)的熱耗散越弱。相反對于無花青素的棉花來說，主要依賴葉黃素循環(huán)的熱耗散維持PSII的穩(wěn)定。

綠葉棉花不含花青素，主要依賴環(huán)式電子途徑建立的ΔpH驅(qū)動葉黃素循環(huán)的熱耗散過程保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免受光損傷；而含有花青素的棉花主要依賴環(huán)式電子建立的質(zhì)子梯度驅(qū)動ATP合成酶合成ATP，合成D1蛋白修復(fù)PSII，減少氧自由基的傷害，另一方面花青素本身具有一定的光破壞防御功能替代了葉黃素循環(huán)的過程耗散過剩激發(fā)能，保護(hù)光合機(jī)構(gòu)。

4 結(jié) 論

隨花青素含量的增加，凈光合速率從34.25減弱至31.43，而吸光系數(shù)由0.83增加至0.87，因此，將面臨較多的過剩激發(fā)能。關(guān)關(guān)熒信號的快速上升的斜率也逐漸增強(qiáng)，并且After AL條件下515信號快速下降的初始斜率也顯著升高，光-暗反應(yīng)條件下515信號葉黃素循環(huán)的熱耗散能力逐漸減弱；無花青素的棉花515信號葉黃素循環(huán)的熱耗散顯著較含花青素的棉花強(qiáng)。含花青素的棉花可以通過花青素的耗散過程維持光合機(jī)構(gòu)的穩(wěn)定，而無花青素的棉花主要通過依賴葉黃素循環(huán)的熱耗散耗散過剩光能保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免受損傷。