王 丹，鄭若欣，馬 康，陳 濤，吉 喆，吳衛(wèi)宇，李芳芳，蘭 余，曹曉念，袁 強(qiáng)，張 琴，劉小剛

（1.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；2.四川國(guó)檢檢測(cè)有限責(zé)任公司，四川瀘州 646000；3.瀘州老窖養(yǎng)生酒業(yè)有限責(zé)任公司，四川瀘州 646000）

生物堿是一類廣泛分布于植物界中重要的天然有機(jī)化合物,具有鎮(zhèn)痛、解熱、抗菌、抗炎、止咳平喘、降血壓、抗心律失常和抗癌等生理活性，也是瑪咖中重要的活性成分之一[1-2]?？偵飰A含量測(cè)定常用的方法有雷氏鹽比色法、酸性染料比色法、酸堿滴定法等。雷氏鹽法利用生物堿在酸性條件下與硫氰酸鉻銨反應(yīng)生成不溶于水的生物堿雷氏銨鹽，丙酮溶解后分光光度法測(cè)定，但限于檢測(cè)季銨型生物堿；酸堿滴定法操作簡(jiǎn)便、成本低廉、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性較好，但靈敏度較低；酸性染料比色法是離子對(duì)萃取比色法中的一種，與分光光度法相結(jié)合，共同測(cè)定總生物堿的含量，靈敏度高、重現(xiàn)性好且操作簡(jiǎn)便[3]。該方法已應(yīng)用在《中華人民共和國(guó)藥典》[4]第一部中藥材總生物堿的測(cè)定。目前瑪咖應(yīng)用于配制酒中形成瑪咖露酒，具有一定的市場(chǎng)規(guī)模，但還未形成瑪咖酒中總生堿含量檢測(cè)方法。本試驗(yàn)建立瑪咖酒中總生物堿檢測(cè)方法并對(duì)該方法進(jìn)行確認(rèn)，以期為瑪咖酒中總生物堿含量檢測(cè)提供準(zhǔn)確有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

瑪咖酒試樣：瀘州老窖養(yǎng)生酒業(yè)有限責(zé)任公司提供；對(duì)照品苦參堿：純度≥98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所；其他化學(xué)試劑均為分析純。

儀器設(shè)備：BS224S型精密電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；S40KpH-電導(dǎo)率-離子綜合測(cè)定儀，美國(guó)梅特勒；U-3900型紫外可見分光光度計(jì)，日本日立公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液及試劑配制

1.2.1.1 溴甲酚綠緩沖液

精密稱取溴甲酚綠0.050 g，加入3 mL的0.2 mol/L氫氧化鈉溶液，再加入1.012 g磷酸二氫鉀和適量蒸餾水溶解，用水定容至100 mL，搖勻，用氫氧化鈉調(diào)至pH4.4，即得。

1.2.1.2 苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取苦參堿對(duì)照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加三氯甲烷溶解定容，得1 mg/mL苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。

苦參堿標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的配制：精密吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，搖勻，即得0.1 mg/mL苦參堿標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

1.2.2 瑪咖酒中總生物堿的提取[5]

取100 mL瑪咖酒試樣于60 ℃水浴揮發(fā)至干，加入10 mL的0.5 %鹽酸溶液溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中定容，再置于250 mL分液漏斗中，加入10 mL三氯甲烷，萃取后下層液置于100 mL燒杯中，上層液中加入10 mL正丁醇，萃取后取上層液合并至燒杯中。下層液用濃氨水調(diào)pH9～10后，再次分別加入10 mL三氯甲烷和正丁醇分別提取，合并萃取液。合并的萃取液過濾后于60 ℃水浴濃縮近至10 mL，至10 mL容量瓶中用正丁醇定容，待測(cè)。

1.2.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)使用液0 mL、0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.3 mL、1.6 mL、1.8 mL，置于25 mL比色管中，各加入1 mL正丁醇，加三氯甲烷至10 mL，加5 mL去離子水，2 mL溴甲酚綠緩沖液，震蕩萃取后，8000 r/min離心5 min后取下層液于最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。通過380～510 nm波段全掃描，形成吸收波長(zhǎng)圖譜，判定最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.4 試樣的測(cè)定

取瑪咖酒試樣的濃縮待測(cè)液1 mL于25 mL比色管中，加三氯甲烷至10 mL，后續(xù)按“1.2.3”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出總生物堿質(zhì)量。

1.2.5 方法的正確度試驗(yàn)

采用陰性樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品加入試驗(yàn)，以平行試驗(yàn)的均值與加入濃度相比較。本方法采用0.1 mg、0.5 mg、1 mg的加標(biāo)量考察正確度。分別取0.1 mL、0.5 mL、1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）于10 mL的50%乙醇溶液中，60 ℃水浴揮發(fā)至干，加入10 mL的0.5 %鹽酸溶液溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中定容，用三氯甲烷-正丁醇提取，濃縮至10 mL，后續(xù)按“1.2.3”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定。

1.2.6 方法的精密度試驗(yàn)

精密稱取瑪咖酒試樣，按照確認(rèn)后的檢測(cè)方法在再現(xiàn)性條件下平行測(cè)定6次，計(jì)算總生物堿含量及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.7 方法的回收率試驗(yàn)

分別取三組6平行已知總生物堿含量的瑪咖酒試樣50 mL，每組加標(biāo)水平為標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）0.05 mL、0.25 mL、0.5 mL，60 ℃水浴揮干，加入10 mL 0.5 %鹽酸溶液溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中定容，用三氯甲烷-正丁醇提取后，濃縮至10 mL，按“1.2.3”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇和標(biāo)準(zhǔn)曲線線性

通過380～510 nm波段掃描，苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液在416 nm處有最大吸收波長(zhǎng)。按照“1.2.3”的方法進(jìn)行試驗(yàn)，繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。如圖1所示，以吸光度為橫坐標(biāo)，苦參堿質(zhì)量濃度（mg）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸處理，得到線性回歸方程y=0.1156x+0.0063（R2=0.9954），線性范圍質(zhì)量濃度0～0.18 mg。

圖1 總生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法的正確度試驗(yàn)

按照“1.2.5”方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

由表1可知，該方法不同水平加標(biāo)下其均值與加入濃度比較，測(cè)定的含量偏差范圍在-8%～6%之間，絕對(duì)偏差均小于10%，即滿足重復(fù)性試驗(yàn)的要求。

表1 正確度驗(yàn)證結(jié)果

2.3 方法的精密度試驗(yàn)

按照“1.2.6”的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。對(duì)總生物堿精密度試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，可得RSD=3.3%。試驗(yàn)表明，該方法測(cè)定總生物堿含量具有較好的再現(xiàn)性。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 方法的回收率試驗(yàn)

按照“1.2.7”的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。由表3可知，2種不同加標(biāo)水平下，加標(biāo)濃度為1 mg/L時(shí)回收率在81 %～93 %之間，加標(biāo)濃度為5 mg/L和10 mg/L時(shí)回收率在90%～96%之間，回收率穩(wěn)定在同一水平。試驗(yàn)表明，該方法測(cè)定總生物堿含量具有較高的準(zhǔn)確性。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立了瑪咖酒中總生物堿的檢測(cè)方法。經(jīng)驗(yàn)證，溴甲酚綠酸性法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍質(zhì)量濃度為0～0.18 mg，線性值為0.9954，正確度偏差范圍在-8%～6%之間，方法精密度RSD=3.3 %，不同濃度加標(biāo)水平下回收率穩(wěn)定。由此可以確認(rèn)采用瑪咖酒樣濃縮后0.5%鹽酸溶解，三氯甲烷-正丁醇提取，溴甲酚綠酸性染料顯色的方式比色檢測(cè)其總生物堿含量的方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，靈敏可靠，可用于瑪咖酒中總生物堿含量的測(cè)定。

試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，以下幾方面會(huì)影響本法測(cè)量的準(zhǔn)確度，需要在測(cè)定中特別注意：（1）在萃取時(shí)需加入過量的氯化鈉以防止乳化反應(yīng)，若萃取時(shí)仍存在乳化則應(yīng)高速離心達(dá)到分層；（2）萃取液濃縮可以選擇水浴鍋或者真空濃縮儀，若選擇真空旋蒸則應(yīng)選擇大容量雞心瓶以避免爆沸；（3）溴甲酚綠顯色時(shí)振搖不能太過劇烈，容易形成完全乳化，造成回收率偏低。