楊 芷 楊 雨 陽金金 王志躍, 楊海明*

(1.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

隨著家禽集約化養(yǎng)殖的快速推進(jìn)，我國肉鵝生產(chǎn)水平得到了巨大提高，但獲得較快生長速度的同時，營養(yǎng)過剩和體脂、腹脂比例偏高的問題也日益突出。家禽的肝臟是機(jī)體脂肪代謝的主要場所，大約90%的脂肪代謝發(fā)生在肝臟，肝細(xì)胞增殖及肝細(xì)胞內(nèi)脂肪合成的強(qiáng)弱直接影響家禽體內(nèi)脂肪的沉積。因此，以鵝胚原代肝細(xì)胞做模型，研究甜菜堿對其脂質(zhì)代謝的作用具有很好的指導(dǎo)作用。國內(nèi)外大量研究均表明，甜菜堿(三甲基甘氨酸)屬季胺型生物堿，能參與脂肪代謝，改善胴體組成，顯著降低動物肝臟中脂肪含量和體內(nèi)脂肪[1]。目前，甜菜堿作為飼料添加劑在畜禽生產(chǎn)中得到了大量的推廣和應(yīng)用，甜菜堿也是機(jī)體中非常重要的甲基供體，其通過控制甲基化反應(yīng)的程度參與表觀遺傳調(diào)控，說明外源攝入甲基供體甜菜堿能改變機(jī)體的表觀遺傳學(xué)特征[2]。

泛酰巰基乙胺酶-1(VNN-1)能催化輔酶A和?；d體蛋白的異化途徑中D-泛酰巰基乙胺的水解，產(chǎn)生泛酸(維生素B5)和巰基乙胺[3]，其在脂類代謝中發(fā)揮重要作用，Rommelaere等[4]對VNN-1缺陷小鼠進(jìn)行基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)了一系列差異表達(dá)基因富集在脂肪酸代謝、甘油酯類代謝和類固醇生物合成等途徑，說明VNN-1基因甲基化水平及其通路在介導(dǎo)甜菜堿調(diào)控鵝脂肪酸合成方面起關(guān)鍵作用[5]。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基添加到胞嘧啶的第5位碳原子(5mC)的過程[6]。甜菜堿作為甲基供體在鵝中調(diào)控脂肪代謝與DNA甲基化的關(guān)系及其機(jī)制仍不明確。VNN-1基因的表達(dá)調(diào)控是否受其DNA甲基化的水平的調(diào)控，需進(jìn)一步驗證研究。

本研究以鵝胚原代肝細(xì)胞為試驗對象，研究不同濃度甜菜堿培養(yǎng)液對鵝胚原代肝細(xì)胞DNA甲基化相關(guān)酶活性和VNN-1啟動子區(qū)域DNA甲基化的影響，通過DNA甲基化酶抑制劑(AZA)探索VNN-1啟動子區(qū)域DNA甲基化調(diào)控基因表達(dá)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

試驗所用江南白鵝種蛋購自常州市四季禽業(yè)有限公司。種蛋孵化溫度為37.5 ℃，相對濕度為75%～80%，轉(zhuǎn)蛋周期為2 h/次。

1.1.2 試劑

RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒和實(shí)時定量PCR(Real-time qPCR)試劑盒購自北京天根科技生化有限公司；試驗用甜菜堿、甲基化酶抑制劑購自美國Sigma公司，外觀為白色至淺黃色粉末或微顆粒，流散性好，純度≥98%；EZ DNA Methylation-GoldTM、BigDye Terminator v1.1、POP-7TM Polymer和HiDiFormamide購自ThermoFisher公司；胎牛血清(FBS)、膠原酶消化液、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；引物、Taq Plus DNA聚合酶購自上海生工生物有限公司；其余一般化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析級。

1.2 試驗方法

1.2.1 鵝胚肝細(xì)胞分離與培養(yǎng)

采用23胚齡受精種鵝蛋分離原代肝細(xì)胞，原代細(xì)胞的分離采用膠原酶消化法進(jìn)行，分離和培養(yǎng)參照本實(shí)驗室前期建立的方法[7]。獲取鵝原代肝細(xì)胞后于5% CO2、40 ℃培養(yǎng)，收集處于指數(shù)生長期的細(xì)胞，以1×108個/L接種于培養(yǎng)板，隔天換液。使用倒置生物顯微鏡觀察細(xì)胞，分別選取培養(yǎng)12、24和36 h的原代肝細(xì)胞進(jìn)行拍照并記錄細(xì)胞形態(tài)及生長狀況。

1.2.2 試驗設(shè)計

1.2.2.1 試驗1：甜菜堿對鵝胚原代肝細(xì)胞DNA甲基化相關(guān)酶活性和VNN-1啟動子區(qū)域DNA甲基化的影響

以鵝原代肝細(xì)胞為研究對象，獲取鵝原代肝細(xì)胞后于5% CO2、40 ℃培養(yǎng)，分別以0(對照)、2.5、5.0和10.0 mmol/L甜菜堿的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每組6個重復(fù)，每個孔為1個重復(fù)，培養(yǎng)液中甜菜堿的濃度參照楊雨等[8]。采用全自動生化分析測定肝細(xì)胞中高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量(由揚(yáng)州諾明哲天醫(yī)學(xué)檢測實(shí)驗室測定)。采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法檢測肝細(xì)胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性(ELISA試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司，貨號：YB-DNMT-Gu)。采用ELISA方法檢測肝細(xì)胞中SAM和S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)含量(ELISA試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司，貨號：YB-SAM-Gu和YB-SAH-Gu)，計算SAM/SAH比值。采用Real-time qPCR方法檢測肝細(xì)胞中VNN-1的基因表達(dá)量。采用亞硫酸氫鹽處理(bisulfite sequencing PCR，BSP)后，測序檢測VNN-1啟動子區(qū)域DNA甲基化水平。

1.2.2.2 試驗2：AZA對鵝胚原代肝細(xì)胞VNN-1和脂肪酸合成酶(FAS)基因表達(dá)的影響

以鵝原代肝細(xì)胞為研究對象，獲取鵝原代肝細(xì)胞后于5% CO2、40 ℃培養(yǎng)，分為4個組，每組6個重復(fù)，每個孔為1個重復(fù)，分別以正常培養(yǎng)液(對照組)、含5 μmol/L的AZA培養(yǎng)液(AZA組)、含5.0 mmol/L甜菜堿培養(yǎng)液(甜菜堿組)、含5 μmol/L的AZA和5.0 mmol/L甜菜堿培養(yǎng)液(AZA+甜菜堿組)繼續(xù)培養(yǎng)96 h。AZA 5-氮雜-2-脫氧胞苷(A3656，Sigma公司)配制成5 μmol/L的培養(yǎng)基，AZA濃度參考Wu等[9]，分別在處理后的0、24、48、96 h，采用Real-time qPCR方法檢測肝細(xì)胞中VNN-1和FAS的基因表達(dá)量。

1.3 測定方法

1.3.1 細(xì)胞總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)微量總RNA提取試劑盒操作說明提取試驗處理后的鵝胚原代肝細(xì)胞總RNA。加入1 mL Trizol充分勻漿，室溫靜置5 min。加入0.2 mL氯仿，振蕩15 s，靜置2 min。4 ℃ 12 000×g離心15 min，棄上清。加入0.5 mL異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10 min。4 ℃ 12 000×g離心10 min，棄上清。加入1 mL 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4 ℃ 7 500×g離心5 min，棄上清。晾干，加入適量ddH2O溶解。將部分總RNA溶液稀釋成300 ng/μL工作液，于-20 ℃保存，剩余總RNA原液于-70 ℃保存?zhèn)溆?。RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Real-time qPCR檢測

以β-肌動蛋白(β-actin)基因為內(nèi)參，釆用SYBR-Green法對肝臟基因表達(dá)量進(jìn)行相對定量分析。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq (2×) 10 μL，上、下游引物和ROX Reference Dye Ⅱ(50×)各0.4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s后，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。熔解曲線繪制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s?；蛞镄畔⒁姳?。

1.3.3 DNA亞硫酸氫鈉修飾法檢測基因啟動子區(qū)域DNA甲基化水平

首先采用亞硫酸氫鈉處理樣品，PCR純化產(chǎn)物連接到pUC18-T載體10個克隆，連接反應(yīng)體系：18 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后制備感受態(tài)細(xì)胞，將細(xì)菌涂布在預(yù)先用20 μL 100 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和100 μL 20 mg/mL X-gal涂布的氨芐青霉素平板上，倒置培養(yǎng)過夜。藍(lán)白斑篩選：選擇在IPTG/X-gal平板上生長的白色菌落，用牙簽挑至含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜。目的片段TA克隆，3%糖凝膠電泳檢測菌落PCR鑒定。質(zhì)粒提取和質(zhì)粒測序M13+/-引物測序。采用軟件DNAStar分析基因序列，采用SeqMan軟件進(jìn)行序列比對，采用QUMA做甲基化圓點(diǎn)圖。檢測的VNN-1基因片段中含有13個CpG位點(diǎn)。在序列中的位置如下：34、78、141、160、203、244、258、271、279、304、316、328、362。編號為1～13位?；蛞镄畔⒁姳?。

表1 基因引物信息

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2017建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 17.0統(tǒng)計對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。方差分析采用一般線性模型，顯著性檢驗采用LSD法，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度甜菜堿對鵝胚原代肝細(xì)胞HDL和LDL含量的影響

由表2可知，2.5、5.0和10.0 mmol/L甜菜堿組肝細(xì)胞LDL含量顯著低于對照組(P<0.05)。培養(yǎng)液中甜菜堿濃度對HDL含量無顯著影響(P>0.05)。

表2 不同濃度甜菜堿對鵝胚原代肝細(xì)胞HDL和LDL含量的影響

2.2 不同濃度甜菜堿對鵝胚原代肝細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的影響

由表3可知，鵝肝細(xì)胞中SAM/SAH比值隨著甜菜堿濃度的增加呈上升趨勢，呈顯著一次線性關(guān)系(P<0.05)。甜菜堿濃度對鵝肝細(xì)胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性無顯著影響(P>0.05)。

表3 不同濃度甜菜堿對鵝胚原代肝細(xì)胞SAM/SAH比值和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的影響

2.3 不同濃度甜菜堿對鵝胚原代肝細(xì)胞VNN-1基因表達(dá)的影響

由圖1可知，5.0和10.0 mmol/L甜菜堿組肝細(xì)胞VNN-1基因表達(dá)量顯著低于對照組和2.5 mmol/L甜菜堿組(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

由圖2可知，5.0和10.0 mmol/L甜菜堿組肝細(xì)胞VNN-1基因啟動子區(qū)域DNA甲基化水平顯著高于對照組(P<0.05)。

Bet:甜菜堿濃度 betaine concentration。圓孔關(guān)閉表明該位點(diǎn)發(fā)生甲基化，圓孔打開表明該位點(diǎn)沒有發(fā)生甲基化。每個CpG位點(diǎn)的甲基化以10個克隆計算。圖a為不同濃度甜菜堿對肝細(xì)胞VNN-1基因啟動子區(qū)域總甲基化圖譜；圖b為不同濃度甜菜堿對肝細(xì)胞VNN-1基因啟動子區(qū)域各CpG位點(diǎn)甲基化水平的影響。

2.4 AZA對鵝胚原代肝細(xì)胞VNN-1和FAS基因表達(dá)的影響

由圖3-a可知，與對照組相比，AZA處理0 h時，不同處理對鵝胚原代肝細(xì)胞VNN-1基因表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)。處理24和48 h時，VNN-1基因表達(dá)量趨勢相同，AZA組VNN-1基因表達(dá)量與對照組差異不顯著(P>0.05)，甜菜堿組和AZA+甜菜堿組VNN-1基因表達(dá)量相比對照組顯著下降(P<0.05)；AZA處理96 h時，各組VNN-1基因表達(dá)量差異顯著，AZA組和AZA+甜菜堿組肝細(xì)胞中VNN-1基因表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)，甜菜堿組VNN-1基因表達(dá)量相比對照組顯著降低(P<0.05)。

由圖3-b可知，與對照組相比，AZA處理后0和24 h，不同處理對鵝胚原代肝細(xì)胞FAS基因表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)；處理48 h時，肝細(xì)胞中AZA組FAS基因表達(dá)量相比對照組顯著升高(P<0.05)；處理96 h時，AZA組和AZA+甜菜堿組FAS基因表達(dá)量相比對照組顯著升高(P<0.05)。

圖3 AZA對鵝胚原代肝細(xì)胞VNN-1和FAS基因表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 甜菜堿對鵝胚原代肝細(xì)胞DNA甲基化相關(guān)酶活性和VNN-1啟動子區(qū)域DNA甲基化的影響

大量研究均表明，甜菜堿作為營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑在降低動物肝臟中脂肪含量和體內(nèi)脂肪有重要作用[10-11]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿處理鵝胚原代肝細(xì)胞后，其LDL含量顯著降低，LDL是富含膽固醇的脂蛋白，是運(yùn)載膽固醇進(jìn)入外周組織細(xì)胞的脂蛋白顆粒，說明甜菜堿能抑制肝細(xì)胞的脂質(zhì)積累。Zhan等[12]發(fā)現(xiàn)肉仔雞飼糧中添加甜菜堿可顯著降低血清甘油三脂和尿酸含量，甜菜堿能通過自身代謝循環(huán)，加速動物體內(nèi)磷脂合成，完善細(xì)胞膜的形成，促進(jìn)肝臟中載脂蛋白的合成，使甘油三酯的遷移速度加快，降低血清甘油三酯含量[13]。由此可見，甜菜堿在促進(jìn)肝臟脂肪代謝方面有重要作用。

甲基供體SAM提供一碳單位后產(chǎn)生SAH，SAH經(jīng)轉(zhuǎn)變后產(chǎn)生高半胱氨酸(Hcy)。SAM/SAH比值會影響DNA甲基化，DNMT的活性依賴于SAM的生成量和SAH的消耗量。當(dāng)SAM/SAH比值升高會伴隨著全身DNA高甲基化[14]。所以，SAM/SAH比值被認(rèn)為是判斷DNA甲基化程度的關(guān)鍵指標(biāo)[15]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，鵝胚原代肝細(xì)胞中添加甜菜堿能提高SAM/SAH比值，提高細(xì)胞整體的DNA甲基化水平，表明甜菜堿作為甲基供體能夠促進(jìn)鵝胚原代肝細(xì)胞甲基化水平，Abobaker等[16]也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，母豬飼糧中添加甜菜堿顯著提高子代膽固醇和皮質(zhì)類固醇基因表達(dá)，且伴隨著啟動子區(qū)域的低甲基化，甜菜堿可以通過表遺傳機(jī)制調(diào)節(jié)新生仔豬肝臟中的膽固醇代謝基因的表達(dá)。

VNN-1是泛酰巰基乙胺的水解酶，大鼠和小鼠基因芯片分析均發(fā)現(xiàn)VNN-1與肝臟脂肪變性密切相關(guān)，其在脂質(zhì)代謝過程中有重要的調(diào)控作用[17-18]。李潔等[19]擴(kuò)增鵝Vanin基因亞型(VNN-1)基因的cDNA序列時發(fā)現(xiàn)，鵝VNN-1基因(GenBank登錄號: KY399733)cDNA全長為1 924 bp，該基因在肝臟中高表達(dá)，共編碼491個氨基酸。VNN的表達(dá)調(diào)控與肝臟脂肪代謝相關(guān)基因過氧化物酶體增殖體激活受體α(PPARα)密切相關(guān)[20-21]。禁食和飼喂降脂藥的野生型小鼠VNN-1的表達(dá)量明顯升高，而在PPARα缺陷小鼠中沒有提高，PPARα可以通過與VNN-1啟動子上的特異性結(jié)合為點(diǎn)結(jié)合促進(jìn)VNN-1基因表達(dá)，揭示其潛在的脂質(zhì)代謝調(diào)控作用[22]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿能提高肝細(xì)胞中VNN-1基因啟動子區(qū)域DNA甲基化水平，但其基因表達(dá)量顯著降低，表明基因的高甲基化會干擾基因的轉(zhuǎn)錄水平，DNA甲基化是由DNA甲基酶催化的表觀遺傳因素，基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化與基因表達(dá)水平一般呈負(fù)反饋調(diào)節(jié)，甜菜堿作為公認(rèn)的甲基供體，能提高VNN-1基因啟動子區(qū)域的甲基化，且負(fù)反饋調(diào)節(jié)其基因表達(dá)。

3.2 AZA對鵝胚原代肝細(xì)胞VNN-1和FAS基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步研究DNA甲基化對VNN-1基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，本試驗還研究了AZA和甜菜堿處理對VNN-1和FAS基因表達(dá)的影響。AZA是一種脫氧胞苷，其在DNA復(fù)制過程中加入到DNA鏈中，另一端能與DNMT結(jié)合，影響DNMT發(fā)生作用，影響DNA甲基化水平，是一種AZA[23-24]。本試驗中，AZA處理96 h時，VNN-1和FAS基因表達(dá)量均發(fā)生顯著變化，AZA組和AZA+甜菜堿組VNN-1基因表達(dá)顯著提高，進(jìn)一步驗證了VNN-1的高表達(dá)與DNA去甲基化相關(guān)。FAS是脂肪酸合成的主要調(diào)節(jié)酶，能夠催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A生成長鏈脂肪酸，對脂肪酸合成有重要作用[25]。處理48 h時，AZA組的FAS基因表達(dá)量比對照組顯著上升，也說明了FAS基因的高表達(dá)與DNA去甲基化相關(guān)。本研究結(jié)果與Shen等[26]研究結(jié)果相一致。Li等[27]也發(fā)現(xiàn)，母豬飼糧中添加甜菜堿可以通過改變胰島素生長因子2(insulin-like growth factors 2，IGF2)的DMR甲基化狀態(tài)來影響海馬神經(jīng)元的增殖。Ling等[28]發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)啟動子區(qū)含有多種去甲基化的CpG位點(diǎn)，高糖能通過去甲基化介導(dǎo)MMP9表達(dá)。Nishizawa等[29]發(fā)現(xiàn)，AZA處理通過去甲基化增強(qiáng)5-氟脲嘧啶的表達(dá)，以上結(jié)果說明DNA去甲基化通常都伴隨著基因表達(dá)的提高，均與本試驗結(jié)果趨勢一致。

4 結(jié) 論

鵝胚原代肝細(xì)胞培養(yǎng)液中添加甜菜堿能抑制肝細(xì)胞的脂質(zhì)積累，提高細(xì)胞總體的DNA甲基化水平，且VNN-1啟動子區(qū)域的甲基化負(fù)反饋調(diào)節(jié)其基因表達(dá)。AZA抑制DNA甲基化后發(fā)現(xiàn)VNN-1和FAS的高表達(dá)與DNA去甲基化相關(guān)。