周 陽 梅士俊 毛勝勇,2 金 巍,2*

(1.國家動(dòng)物消化道營養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心，江蘇省消化道營養(yǎng)與動(dòng)物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物研究室，南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)類國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，南京 210095)

反芻動(dòng)物的飼糧含有豐富的膽堿，研究已經(jīng)證實(shí)膽堿在瘤胃中能夠被微生物快速降解，生成三甲胺，能夠到達(dá)小腸的飼糧源膽堿很少[5-6]。目前，關(guān)于飼糧膽堿含量對(duì)瘤胃微生物和血漿TMAO含量的影響還鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬通過在湖羊飼糧中添加氯化膽堿，結(jié)合高通量測(cè)序方法和靶向代謝組學(xué)技術(shù)，研究飼糧氯化膽堿含量變化對(duì)瘤胃菌群和血漿TMAO含量的影響，為反芻動(dòng)物的健康養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用氯化膽堿未包被，含量99%，購自蘇州某生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)于2018年12月19日至2019年1月24日在江蘇徐州蘇羊羊業(yè)有限公司進(jìn)行。試驗(yàn)選用12只育肥期健康公湖羊，體重(30.2±2.0) kg，隨機(jī)分為2組，每組6只羊，單欄飼養(yǎng)。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧；參考前期的研究結(jié)果和氯化膽堿在生產(chǎn)中的添加劑量，試驗(yàn)組飼糧在基礎(chǔ)飼糧中添加0.05%的氯化膽堿。2組飼糧均制成全混合顆粒料，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，參照《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 815—2004)中育肥肉羊營養(yǎng)需要量配制。試驗(yàn)預(yù)試期5 d，正試期28 d。試驗(yàn)期間，每天飼喂2次(08:00和16:00)，自由采食和飲水。每天記錄采食量，每周晨飼前稱重1次。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 樣品采集

正式期第27天于早晨飼喂前用裝有肝素鈉的真空采血管通過頸靜脈取血，1 125×g離心15 min，取上清備測(cè)血漿TMAO含量。正試期第28天于早晨飼喂前屠宰采集瘤胃內(nèi)容物用于細(xì)菌測(cè)序；采集瘤胃液經(jīng)4層紗布過濾，濾液一部分用于測(cè)定pH，另一部分用于揮發(fā)性脂肪酸和氨氮含量的測(cè)定。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸和氨氮含量的測(cè)定

瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸含量參照J(rèn)in等[7]方法，利用安捷倫7890B(Agilent, California, USA)氣相色譜儀測(cè)定，色譜柱采用Fused silica capillary column (Supelco, Bellefonte, USA)。測(cè)定氨氮含量時(shí)，先將瘤胃液樣品4 000 r/min離心10 min(Scientific Sorvall Legend Micro 21R微量離心機(jī)，德國Thermo Fisher公司)取上清，參照Weatherburn[8]描述的方法，使用氯化銨作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用比色法測(cè)定。

1.4.2 血漿TMAO含量的測(cè)定

體重管理除了控制飲食外還需適量的運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)和飲食就像一對(duì)雙胞胎，一個(gè)都不能少，孕婦需要適量的運(yùn)動(dòng)和合理的飲食才能控制整個(gè)孕期的增重量，把寶寶的體重控制在3千克左右，為自然分娩、母乳喂養(yǎng)和寶寶一輩子的健康打下良好的基礎(chǔ)。

血漿中TMAO的含量參照Xin等[9]的方法，利用LC-MS測(cè)定。100 μL血漿與200 μL乙腈混合沉淀蛋白，14 000×g離心10 min，2 μL上清液注入U(xiǎn)3000 DGLC系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific, Waltham,美國)和Q Exactive質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific, Waltham,美國)，TMAO在Waters BEH Amide column色譜柱上分離。檢測(cè)數(shù)據(jù)利用Xcalibur和TraceFinder 4.1(Thermo Fisher Scientific, Waltham,美國)收集和分析。

1.4.3 瘤胃微生物DNA提取

瘤胃微生物的DNA提取參照J(rèn)in等[7]方法。采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)結(jié)合酚-氯仿-異戊醇法提取。使用NanoDrop ND-2000(Thermo Fisher Scientific，美國)測(cè)定DNA濃度和純度，保證提取的樣品DNA的OD260/OD280在1.80～2.00，保存DNA樣品于-80 ℃冰箱備用。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.4.5 細(xì)菌16S rRNA基因的高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)[12]。擴(kuò)增產(chǎn)物利用Illumina MiSeq PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(凌恩生物科技有限公司)。測(cè)序原始數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳到NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為SRP271556。

高通量數(shù)據(jù)分析參照Xie等[13]方法，利用QIIME軟件(1.9.0版)進(jìn)行。利用UPARSE在0.03水平上聚類操作分類單元(OTUs)[14]，α和β多樣性分析在序列深度29070上進(jìn)行?；赨nweighted UniFrac metric進(jìn)行主成分分析(PCoA)[15]?；赟ILVA數(shù)據(jù)庫(Release132 http://www.arb-silva.de)對(duì)OTUs的代表性序列進(jìn)行系統(tǒng)分類[16]。利用相似性分析(ANOSIM)評(píng)估組間菌群差異。利用線性判別(LDA)分析和LDA效應(yīng)大小分析(LEfSe)找出導(dǎo)致組間菌群變化的生物標(biāo)志物[17]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。平均日采食量、平均日增重、料重比、瘤胃發(fā)酵參數(shù)、血漿TMAO含量以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。微生物數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis H(K)非參數(shù)檢驗(yàn)分析。P<0.05表示差異顯著，0.05

2 結(jié) 果

2.1 添加氯化膽堿對(duì)湖羊生長性能的影響

如表2所示，添加0.05%的氯化膽堿對(duì)湖羊平均日采食量(P=0.879)、平均日增重(P=0.234)和料重比(P=0.164)沒有顯著影響。

表2 添加氯化膽堿對(duì)湖羊生長性能的影響

2.2 添加氯化膽堿對(duì)湖羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)和血漿TMAO含量的影響

如表3所示，添加氯化膽堿對(duì)瘤胃液pH沒有顯著影響(P=0.817)，也沒有顯著影響瘤胃揮發(fā)性脂肪酸(P>0.05)和氨氮含量(P=0.883)，但有增加血漿TMAO含量的趨勢(shì)(P=0.075)。

表3 添加氯化膽堿對(duì)湖羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)和血漿TMAO含量的影響

2.3 添加氯化膽堿對(duì)湖羊瘤胃古菌和Mmc 16S rRNA基因以及細(xì)菌cutC基因豐度的影響

如表4所示，添加氯化膽堿沒有對(duì)瘤胃內(nèi)容物中古菌16S rRNA基因(P=0.452)和細(xì)菌cutC基因(P=0.462)豐度產(chǎn)生顯著影響，但顯著提高了Mmc的16S rRNA基因(P=0.016)的豐度以及Mmc占古菌的比例(P=0.008)。

表4 添加氯化膽堿對(duì)湖羊瘤胃古菌和Mmc 16S rRNA基因以及細(xì)菌cutC基因豐度的影響

2.4 添加氯化膽堿對(duì)湖羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響

如表5所示，測(cè)序覆蓋度大于0.99，表明測(cè)序數(shù)據(jù)量可以代表樣品中的細(xì)菌菌群。添加氯化膽堿沒有顯著影響OTUs、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)(P>0.05)。PCoA結(jié)果顯示，添加氯化膽堿對(duì)瘤胃菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著影響(圖1，ANOSIM,P<0.009)。

相似性分析(ANOSIM)，P=0.009; 紅色: 試驗(yàn)組,綠色: 對(duì)照組。

表5 添加氯化膽堿對(duì)湖羊瘤胃菌群α多樣性的影響

如圖2所示，在相對(duì)豐度大于0.1%的條件下，2個(gè)組共有9個(gè)門。2個(gè)組的優(yōu)勢(shì)菌群主要為厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。添加氯化膽堿未顯著影響細(xì)菌門水平上的相對(duì)豐度(P>0.05)。

Firmicutes:厚壁菌門；Bacteroidetes:擬桿菌門；Actinobacteria:放線菌門；Spirochaetae:螺旋體門；Candidate_division_TM7:被分類為細(xì)菌域候選TM7；Proteobacteria:變形菌門；Tenericutes:無壁菌門；Fibrobacteres: 纖維桿菌門；Cyanobacteria:藍(lán)藻菌門。

如圖3所示，相對(duì)豐度大于0.5%的屬有29個(gè)。2組優(yōu)勢(shì)菌屬均為普雷沃氏菌屬(Prevotella)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、瘤胃球菌科中1個(gè)未分類的屬Unclassified S24-7和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)，這4個(gè)屬相對(duì)豐度均在5%以上。2組之間的細(xì)菌相對(duì)豐度在屬水平上無顯著差異(P>0.05)。

Syntrophococcus:互營球菌屬；Unclassified Erysipelotrichaceae:未分類丹毒絲菌科；Unlassified Veillonellaceae:未分類韋榮球菌科；Succiniclasticum:琥珀酸菌屬；Unclassified Lachnospiraceae:未分類毛螺菌科；Unclassified Christensenellaceae:未分類的克里斯滕森菌科；Roseburia:羅氏菌屬；Acetitomaculum:聚乙酸菌屬；Treponema:螺旋體菌屬；RC9_gut_group:理研菌科RC9 gut群；Unclassified Prevotellaceae:未分類普雷沃氏菌科；Lachnospiraceae-Incertae-Sedis:毛螺菌屬；Unclassiied Ruminococcaceae:未分類瘤胃球菌科；Ruminococcus:瘤胃球菌屬；Unclassified S24_7:未分類S24_7；Butyrivibrio:丁酸弧菌屬；Prevotella:普雷沃氏菌屬。

如圖4所示，當(dāng)閾值設(shè)定為3.0時(shí)，通過LDA分析發(fā)現(xiàn)韋榮球菌科(Veillonellaceae)和Oribacterium在對(duì)照組中富集，擬桿菌科(Bacteroidaceae)、擬桿菌屬(Bacteroides)、柔膜菌綱(Mollicutes)、無壁菌門(Tenericutes)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、柔膜細(xì)菌RF9在試驗(yàn)組中富集。

Veillonellaceae:韋榮球菌科；Rickettsiales:立克次氏體目；Quinella:奎因氏菌屬；Anaerovorax:厭氧弧菌屬；Enteroccus:腸球菌屬；Enterococcaceae:腸球菌科；Erysipelothrix:丹毒絲菌屬；Bacilli:芽孢桿菌屬；Lactobacillales:乳酸桿菌屬；Anaerotruncus:厭氧球菌屬；Rhodospirillales:紅螺菌目；Thalassospira:海旋菌屬；Rhodospirillaceae: 紅螺菌科；Betaproteobacteria:β-變形菌綱；Burkholderiales:伯克氏菌目；Parabacteroides:副擬桿菌屬；Porphyromonadaceae:紫單孢菌科；Enterobacteriaceae:腸桿菌科；Enterobacteriales:腸桿菌目；Escherichia-Shigella:埃希氏桿菌屬-志賀氏菌；Blautia:布勞特氏菌屬；Parasutterella:毛螺璇菌屬；Alcaligenaceae:產(chǎn)堿桿菌科；Gammaproteobacteria: γ-變形菌綱；Tenericutes:無壁菌門；Mollicutes:柔膜菌綱；Bacteroides:擬桿菌屬。

3 討 論

本研究在飼糧中添加0.05%的氯化膽堿沒有顯著影響湖羊的生長性能。膽堿在瘤胃中會(huì)被微生物快速降解成三甲胺，只有少量膽堿能夠到達(dá)小腸并被動(dòng)物吸收[18]，因此添加的氯化膽堿基本不能被動(dòng)物利用。添加的氯化膽堿對(duì)飼糧粗蛋白質(zhì)增加量僅為0.031%，沒有對(duì)動(dòng)物生長性能產(chǎn)生顯著影響。

添加0.05%的氯化膽堿沒有顯著影響湖羊瘤胃pH、VFA和氨氮含量，但改變了湖羊瘤胃細(xì)菌和甲烷菌菌群結(jié)構(gòu)。Kelly等[19]通過利用膽堿三甲胺裂解酶檢索瘤胃微生物宏基因組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)瘤胃中膽堿降解菌主要分布在放線菌門(Actinobacteria)、Firmicutes和變形菌門(Proteobacteria)3個(gè)門中，雖然分布較廣，但目前比對(duì)出來的7個(gè)細(xì)菌屬都不是瘤胃菌群中豐富和普遍的成員。瘤胃中主要的膽堿降解菌是歐爾森氏菌屬(Olsenellaumbonata)和Caecibacter，但主要菌屬存在動(dòng)物物種差異，羊瘤胃中主要是Olsenella和Caecibacter，牛瘤胃中是Olsenella、Caecibacter和真桿菌屬(Eubacterium)。本研究湖羊瘤胃中Olsenella和Eubacterium的相對(duì)豐度均較低，未檢測(cè)到Caecibacter的存在，本研究的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了膽堿降解菌在瘤胃中并不是優(yōu)勢(shì)菌群。本研究中對(duì)試驗(yàn)組菌群變異貢獻(xiàn)最大的是擬桿菌門的擬桿菌屬和軟壁菌門的RF9，然而目前尚未發(fā)現(xiàn)在這2個(gè)門中有編碼膽堿三甲胺裂解酶的cutC基因分布[19-20]，引起這2個(gè)菌群變化的原因尚不清楚。這些變化的菌群可能與膽堿利用有關(guān)，如原蟲可利用瘤胃中游離膽堿合成自身的磷脂酰膽堿[21]，仍需進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

添加氯化膽堿促進(jìn)了瘤胃中Mmc甲烷菌的增殖。Mmc是瘤胃中利用三甲胺的主要甲烷菌[22]，這一甲烷菌的增殖暗示瘤胃中三甲胺增多，這表明添加的氯化膽堿在瘤胃中被降解為三甲胺。將膽堿降解為三甲胺和乙醛需要細(xì)菌膽堿三甲胺裂解酶的作用[6]，然而實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示瘤胃內(nèi)容物中編碼膽堿三甲胺裂解酶的cutC基因豐度沒有顯著變化，這可能是由于添加的氯化膽堿未達(dá)到引起膽堿降解細(xì)菌增殖的量；另一個(gè)可能的原因是cutC基因的表達(dá)量增加了，然而本研究未能對(duì)此進(jìn)行證實(shí)。

在血漿中檢測(cè)到TMAO，表明三甲胺從胃腸道轉(zhuǎn)移到了湖羊的血液循環(huán)。盡管飼糧中氯化膽堿含量增加促進(jìn)了瘤胃中三甲胺利用菌Mmc甲烷菌的增殖，但由Mmc甲烷菌增殖而提升的三甲胺的利用能力未能完全抵消瘤胃中三甲胺增加的量，導(dǎo)致試驗(yàn)組湖羊血漿中TMAO含量有升高的趨勢(shì)。這暗示飼糧中膽堿水平升高可能會(huì)導(dǎo)致更多的三甲胺進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體，這可能會(huì)對(duì)動(dòng)物健康造成潛在的危害。雖然未包被的氯化膽堿已經(jīng)不在反芻動(dòng)物的飼糧中使用，但飼料原料中含有豐富的三甲胺前體物質(zhì)，如膽堿、甜菜堿、卵磷脂等。不同的飼料原料中這些物質(zhì)含量不同，在飼料配方設(shè)計(jì)的時(shí)候需要綜合考慮，盡量減少瘤胃中三甲胺的生成，降低對(duì)動(dòng)物健康的危害。

此外，目前在反芻動(dòng)物飼料添加劑上廣泛使用的是過瘤胃氯化膽堿，但我們需要注意的是即便膽堿能夠到達(dá)小腸，大部分的膽堿也有可能不能被動(dòng)物吸收利用。有文獻(xiàn)報(bào)道，到達(dá)小腸的膽堿僅有1/3被吸收進(jìn)入腸細(xì)胞，2/3的膽堿被腸道微生物降解成三甲胺，以三甲胺的形式很快地被吸收進(jìn)入門靜脈[4]。

4 結(jié) 論

添加0.05%的氯化膽堿未對(duì)湖羊生長性能和瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生影響，但改變了瘤胃細(xì)菌和甲烷菌的菌群結(jié)構(gòu)，有提高血漿中TMAO含量的趨勢(shì)，這一結(jié)果暗示飼糧中膽堿含量的變化能夠影響進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體的三甲胺的量。進(jìn)入機(jī)體的三甲胺增多，不但增加肝臟的解毒負(fù)擔(dān)，產(chǎn)生的TMAO還對(duì)動(dòng)物的健康造成潛在的危害。