崔 喬 郝小燕 張宏祥 陳彥華 項斌偉 張文佳 張春香 張建新*
(1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院,太谷 030801;2.山西祥和嶺上農(nóng)牧開發(fā)有限公司,右玉 037200;3.山西安弘檢測技術(shù)有限公司,太原 030000;4.山西省右玉縣畜牧獸醫(yī)中心,右玉 037200)
近年來,由于限抗、禁抗等政策,在動物生產(chǎn)中應(yīng)用植物提取物替代抗生素受到研究者的廣泛關(guān)注。植物提取物是植物的次生性代謝產(chǎn)物,對細菌、真菌、原蟲、病毒等微生物有選擇性抗菌活性。因此,許多植物提取物能夠調(diào)控反芻動物瘤胃微生物發(fā)酵[1]。肉桂為樟科常綠喬木植物,主要分布在廣東、廣西、云南、福建等地區(qū),其中廣東、廣西的肉桂產(chǎn)量約占世界產(chǎn)量的80%。肉桂醛(cinnamaldehyde,CA)又稱桂醛、桂皮醛、三苯基丙烯醛,屬醛類有機化合物,具有抑菌、殺菌、抗病毒、抗氧化等生物學功能。Yang等[2]在肉牛高精料飼糧中添加CA,結(jié)果表明,CA能夠調(diào)節(jié)反芻動物瘤胃發(fā)酵,影響肉牛對飼糧氮利用。Khorrami等[3]利用CA替代莫能菌素應(yīng)用于肉牛生產(chǎn),其結(jié)果表明,CA可以降低肉牛瘤胃原蟲數(shù)量和乙酸/丙酸。研究發(fā)現(xiàn),CA能影響犢牛瘤胃微生物發(fā)酵,在犢牛開食料中添加CA能夠降低瘤胃乙酸和總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度,提高丙酸濃度[4]。金恩望等[5]在體外研究中發(fā)現(xiàn),添加肉桂精油能夠顯著提高發(fā)酵72 h時微生物蛋白(MCP)的產(chǎn)量。據(jù)統(tǒng)計,反芻動物瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的甲烷(CH4)占總排放量的26%,同時占飼料能量的5%~12%,不但加劇溫室效應(yīng),而且降低動物對飼料能量的利用率[6]。石寧等[7]體外研究表明,肉桂精油可以改善瘤胃發(fā)酵,降低CH4產(chǎn)量。目前,CA在單胃動物生產(chǎn)中的應(yīng)用較廣泛,而有關(guān)CA在反芻動物上的應(yīng)用和研究主要集中于肉牛和奶牛,在肉羊上的應(yīng)用較少,且影響效果及適宜添加量不確定。因此,本試驗采用尼龍袋法和體外產(chǎn)氣法研究不同添加水平的CA對肉羊飼糧營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解特性及體外發(fā)酵參數(shù)的影響,為CA在肉羊生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
試驗所用CA購自西安某科技有限公司,純度為20%,紅色粉末狀,其余為無功能肉桂殘渣。
本試驗采用單因子試驗設(shè)計,選用12只體況良好、年齡相近、體重(50±2) kg、裝有永久性瘤胃瘺管的杜×寒雜交羯羊作為試驗動物。參考NRC(2007)綿羊營養(yǎng)需要配制基礎(chǔ)飼糧,其組成及營養(yǎng)水平見表1,精粗比為70∶30。將12只試驗羊隨機分為4組,每組3只,單欄飼喂,并且每千克基礎(chǔ)飼糧中分別添加0(對照組)、200(200CA組)、300(300CA組)、400 mg(400CA組)的CA。預(yù)飼15 d,每天08:00、18:00各飼喂1次,自由飲水。預(yù)飼結(jié)束后投放尼龍袋,測定營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))
選用10 cm×8 cm(孔徑為50 μm)尼龍袋,編號并清洗干凈,放65 ℃烘箱中烘48 h,回潮24 h后稱重記錄。將各組飼糧粉碎,過40目篩,準確稱取5 g(精確至0.000 1 g)飼糧樣品并無損轉(zhuǎn)入尼龍袋中,每組3個重復(fù),每個重復(fù)2個平行。尼龍袋按照“依次放入,同時取出”原則放入瘤胃。發(fā)酵時間點設(shè)置為0、6、12、24、36、48、72 h。發(fā)酵72 h后尼龍袋全部取出,利用冷的自來水沖洗(包括0 h),直至水澄清,放入65 ℃的烘箱中烘48 h,再回潮24 h,稱重后將尼龍袋中的殘渣分裝,用于營養(yǎng)物質(zhì)含量測定。
被測樣品中某營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率的計算公式:
被測樣品中某營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率(%)=[(被測樣品中該營養(yǎng)物質(zhì)含量-殘留物中該營養(yǎng)物質(zhì)含量)/被測樣品中該營養(yǎng)物質(zhì)含量]×100。
利用?rskov等[8]提出的指數(shù)模型計算瘤胃降解參數(shù):
P=a+b(1-e-ct)。
式中:P為在t時間點樣品中某營養(yǎng)物質(zhì)的瘤胃降解率(%);a為快速降解部分(%);b為慢速降解部分(%);c為慢速降解部分的降解速率(h-1);t為樣品中該營養(yǎng)物質(zhì)降解所用的時間(h)。
被測樣品中某營養(yǎng)物質(zhì)的瘤胃有效降解率(ED)=a+b×c/(c+k)。
式中:k為樣品中該營養(yǎng)物質(zhì)的外流速率常數(shù)(h-1),本試驗中k值為0.031。
本試驗參考Menke等[9]方法,采用DHP-9162型恒溫培養(yǎng)箱、玻璃注射器(德國Harberle公司)、分液裝置(德國Poulten and Graf GmbH)以及培養(yǎng)液分裝槽(北京方正興達科技發(fā)展公司)等裝置進行體外發(fā)酵試驗。
1.4.1 發(fā)酵底物準備
將基礎(chǔ)飼糧粉碎,過40目篩后分別在每千克基礎(chǔ)飼糧中添加0(對照組)、200(200CA組)、300(300CA組)、400 mg(400CA組)的CA,充分混合均勻,作為發(fā)酵底物。準確稱量0.2 g(精確至0.000 1 g)飼糧樣品,無損轉(zhuǎn)入體外消化-移動尼龍小袋(35 mm×75 mm,孔徑為40 μm,北京一牛肉牛研究中心),封口,放入100 mL玻璃注射器內(nèi),39 ℃預(yù)熱,備用。每個飼糧樣品設(shè)6個平行。
1.4.2 瘤胃液采集
晨飼前采集3只僅飼喂基礎(chǔ)飼糧的瘺管羊的瘤胃液,4層紗布過濾,置于39 ℃預(yù)熱且無氧的暖瓶中備用。
1.4.3 體外培養(yǎng)
將瘤胃液與人工唾液按照1∶2混合作為體外發(fā)酵的培養(yǎng)液,通入CO2并使用磁力攪拌器攪拌均勻。每個玻璃注射器中裝30 mL培養(yǎng)液,排盡空氣,記錄其初始刻度,同時設(shè)置3個空白管(只添加培養(yǎng)液,不放飼糧樣品)??焖賹⒉Aё⑸淦饕来畏湃?9 ℃的恒溫搖床培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)48 h。
1.4.4 樣品采集
分別于培養(yǎng)0、3、6、9、12、18、24、36和48 h時讀取并記錄注射器刻度值,當讀數(shù)超過80 mL時,采用集氣袋收氣并保存,用于測定CH4濃度。48 h后終止發(fā)酵,收集培養(yǎng)液并立即測定pH,隨后將培養(yǎng)液置于-20 ℃冷凍保存,用于測定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、氨態(tài)氮(NH3-N)和MCP濃度。
1.4.5 指標測定
利用氣相色譜儀(Agilent 7890B,美國)測定CH4濃度;參考Wang等[10]的方法,利用氣相色譜儀測定VFA濃度,計算TVFA濃度以及TVFA中乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸的比例及乙酸/丙酸;利用考馬斯亮藍G-250作為指示劑,使用比色法[11]測定MCP濃度;采用亞硝基鐵氰化鈉-次氯酸鈉比色法測定NH3-N濃度。
采用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行初步整理,然后使用SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比較,并進行線性和二次回歸分析。P<0.05為差異顯著,0.05≤P≤0.10為有趨勢。
由表2可知,200CA、300CA組DM的瘤胃降解率在各時間點均顯著高于對照組(P<0.05)。200CA、300CA、400CA組DM的快速降解部分及瘤胃有效降解率均顯著高于對照組(P<0.05)。
表2 添加不同水平的CA對DM瘤胃降解特性的影響
由表3可知,在6~72 h,200CA、300CA組CP的瘤胃降解率顯著高于對照組(P<0.05);在24~72 h,400CA組CP的降解率顯著低于對照組(P<0.05)。400CA組的CP的快速降解部分、慢速降解部分及慢速降解部分的降解速率均顯著低于其余各組(P<0.05)。200CA和300CA組的CP瘤胃有效降解率顯著高于對照組(P<0.05),而400CA組CP瘤胃有效降解率則顯著低于對照組(P<0.05)。
表3 添加不同水平的CA對CP瘤胃降解特性的影響
由表4可知,在6~72 h,200CA、300CA、400CA組NDF的瘤胃降解率顯著高于對照組(P<0.05),同時NDF的快速降解部分及瘤胃有效降解率也均顯著高于對照組(P<0.05),且以400CA組最高,但與200CA、300CA組差異不顯著(P>0.05)。
表4 添加不同水平的CA對NDF瘤胃降解特性的影響
由表5可知,在6~72 h,200CA、300CA、400CA組ADF的瘤胃降解率均顯著高于對照組(P<0.05),同時ADF的快速降解部分與瘤胃有效降解率也均顯著高于對照組(P<0.05)。
表5 添加不同水平的CA對ADF瘤胃降解特性的影響
由表6可知,在體外發(fā)酵試驗中,產(chǎn)氣量隨發(fā)酵時間的延長而增加,各組的不同時間點的產(chǎn)氣量均無顯著差異(P>0.05),但在16~48 h,產(chǎn)氣量隨CA添加水平的增加呈線性降低(P<0.05)或降低趨勢(0.05≤P≤0.10)。
表6 添加不同水平的CA對體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響
由表7可知,添加不同水平的CA對發(fā)酵液pH無顯著影響(P>0.05);發(fā)酵液中NH3-N濃度隨CA添加水平的增加呈線性和二次曲線降低(P<0.05),且各CA添加組均顯著低于對照組(P<0.05)。發(fā)酵液中MCP濃度各組之間無顯著差異(P>0.05);CH4濃度隨CA添加水平的增加呈線性或二次曲線降低(P<0.05),且300CA、400CA組顯著低于對照組(P<0.05)。
表7 添加不同水平的CA對體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響
由表8可知,在體外發(fā)酵試驗中,各組發(fā)酵液中TVFA濃度無顯著差異(P>0.05),且添加不同水平的CA對異丁酸、異戊酸及戊酸的比例無顯著影響(P>0.05)。發(fā)酵液VFA中,300CA組乙酸的比例較對照組顯著降低(P<0.05);丙酸的比例隨CA添加水平的增加呈線性和二次曲線增加(P<0.05),300CA、400CA組顯著高于對照組(P<0.05);300CA、400CA組丁酸的比例較對照組有增加的趨勢(0.05≤P≤0.10),且丁酸的比例隨著CA添加水平的增加呈線性和二次曲線增加(P<0.05);乙酸/丙酸隨CA添加水平的增加呈線性或二次曲線降低(P<0.05),且200CA、300CA、400CA組顯著低于對照組(P<0.05)。
表8 添加不同水平的CA對體外瘤胃發(fā)酵液VFA組成的影響
CA是一種新型綠色飼料添加劑,飼糧中添加適量的CA能夠改善瘤胃內(nèi)環(huán)境[12]。Macheboeuf等[13]研究表明,CA的抑菌作用是醛類有機物中最強的,低濃度的CA即可調(diào)控瘤胃發(fā)酵。林波等[14]體外發(fā)酵試驗結(jié)果表明,植物揮發(fā)油在適當?shù)臐舛认驴捎行д{(diào)控瘤胃發(fā)酵,而添加高濃度的肉桂醛時TVFA濃度急劇下降,瘤胃發(fā)酵受到抑制。飼糧中的營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃中的降解率反映了飼料原料被消化利用的難易程度,是飼糧營養(yǎng)物質(zhì)被動物機體利用程度的重要指標[15]。Tekippe等[16]在奶牛飼糧中添加CA后提高了飼糧中NDF的消化率。An等[17]研究表明,飼糧中添加CA可提高營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃中的降解率。Yang等[2]給帶有瘤胃及十二指腸瘺管的肉牛飼糧中添加不同水平的CA,結(jié)果表明,給肉牛補飼低劑量的CA對其干物質(zhì)采食量的影響較小,但可以提高其對飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用。林波等[18]在湖羊飼糧中添加肉桂油、丁香油、牛至油等不同植物精油后發(fā)現(xiàn),湖羊瘤胃中NH3-N的濃度及飼糧CP瘤胃降解率顯著降低。本試驗中,各CA添加組飼糧DM、NDF及ADF的瘤胃有效降解率顯著高于對照組,200CA、300CA組CP的瘤胃有效降解率顯著高于對照組,而400CA組CP的瘤胃有效降解率顯著低于對照組,這證明了適量的CA可以提高飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃中的降解率,也可以提高飼糧蛋白質(zhì)在瘤胃中的存留率,這種效果與CA的添加水平高度相關(guān)。營養(yǎng)物質(zhì)降解率的提高可能與添加適量的CA后選擇性的提高了瘤胃細菌、真菌的活性,改善了瘤胃功能有關(guān)。同時,有研究表明,CA能夠抑制部分瘤胃原蟲的活性[19],而原蟲具有蛋白質(zhì)水解活性和脫氨基活性[20]。因此,在肉羊飼糧中添加一定水平的CA時,CP的瘤胃有效降解率降低,使進入小腸的蛋白質(zhì)的量增加。
產(chǎn)氣量是反映飼糧可發(fā)酵程度及瘤胃微生物活性的重要指標[21]。目前,關(guān)于CA及肉桂油對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的大多數(shù)研究表明,隨著CA或肉桂油添加水平的增加,總產(chǎn)氣量無顯著變化或顯著降低。本試驗中,各組之間的總產(chǎn)氣量(72 h產(chǎn)氣量)無顯著差異,但與對照組相比,試驗組產(chǎn)氣量隨CA添加水平的增加呈線性降低趨勢,這與前人的研究基本一致。反芻動物瘤胃合成CH4的主要途徑是氫氣(H2)還原二氧化碳(CO2)生成CH4,其次是利用乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸生成CH4[22]。林波等[14]體外研究發(fā)現(xiàn),添加50 mg/L CA和肉桂醛油時,CH4產(chǎn)量較對照組分別降低16.5%和21.4%,總產(chǎn)氣量分別降低8.5%和10.4%,但與對照組相比差異不顯著,但其添加水平高于500 mg/L時能顯著降低CH4產(chǎn)量及總產(chǎn)氣量,總產(chǎn)氣量分別降低57.2%和51.2%,瘤胃發(fā)酵受到抑制。Blanch等[23]研究發(fā)現(xiàn),體外條件下添加適宜濃度的CA和大蒜油,能夠顯著降低CH4的產(chǎn)量。王東升等[24]體外發(fā)酵試驗表明,添加100 mg/L的肉桂油能夠顯著降低CH4產(chǎn)量及總產(chǎn)氣量。在本試驗中,發(fā)酵液中CH4濃度隨CA添加水平的增加線性降低,與上述前人的研究基本一致。這可能是由于CA抑制了產(chǎn)甲烷菌的活性[25],導(dǎo)致CH4產(chǎn)量降低,但H2和CO2產(chǎn)量增加,同時,瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的H2被用來合成丙酸,使得合成CH4的底物減少,進而降低CH4產(chǎn)量,總產(chǎn)氣量無顯著變化,這也與本試驗發(fā)酵液中丙酸比例升高的結(jié)果相一致。
瘤胃液pH可以反映瘤胃內(nèi)環(huán)境的狀態(tài),受飼糧類型、動物唾液分泌量以及有機酸濃度的共同影響[7],pH過高或過低均會抑制瘤胃微生物生長,對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生負面影響。本次體外發(fā)酵試驗結(jié)果表明添加CA后對發(fā)酵液pH無顯著影響,且pH均在6.2~6.8,在適宜瘤胃微生物生長的pH范圍內(nèi),這可能是由于體外瘤胃發(fā)酵試驗中緩沖液對維持pH的穩(wěn)定起了重要作用。飼糧中的蛋白質(zhì)在瘤胃菌群的作用下降解為NH3-H,一部分被瘤胃微生物利用合成MCP,進而被機體吸收利用。因此,瘤胃中NH3-N及MCP的濃度是反映瘤胃氮代謝的重要指標。目前,關(guān)于CA或肉桂精油對NH3-N濃度影響的研究已經(jīng)有很多報道,但結(jié)果存在差異。Fraser等[26]研究表明,500 mg/L的肉桂油能夠顯著降低NH3-N的濃度。CA是肉桂精油的主要活性成分,Busquet等[4]研究表明,CA比肉桂精油對瘤胃發(fā)酵的影響大,CA可以通過降低脫氨基作用降低發(fā)酵液中NH3-N的濃度,從而影響瘤胃氮代謝。金恩望等[5]利用體外產(chǎn)氣法研究了不同植物精油對瘤胃發(fā)酵的影響,結(jié)果表明,不同添加水平的植物精油均會不同程度的降低NH3-N的濃度,但對MCP的濃度無顯著影響。Jahani-Azizabadi等[27]利用批次培養(yǎng)法研究植物精油對瘤胃發(fā)酵特性的影響,結(jié)果表明,發(fā)酵液中添加20 μL/L的肉桂油能顯著降低NH3-N濃度及CH4產(chǎn)量。本試驗結(jié)果也表明,添加不同水平的CA均能降低發(fā)酵液中NH3-N濃度,但對MCP濃度無顯著影響。瘤胃中的NH3-N大部分(總量的50%以上)是由瘤胃中的超級產(chǎn)氨細菌(HAP)產(chǎn)生的,HAP僅占瘤胃細菌總數(shù)的1%左右,卻有非常高的脫氨基活性[28]。研究表明,植物精油能夠選擇性的抑制HAP,從而降低瘤胃中NH3-N的濃度[29]。除此之外,肉桂醛能夠降低普雷沃菌屬的數(shù)量,從而降低瘤胃液中NH3-N的濃度[30]。然而,王東升等[24]研究顯示,添加CA(100 mg/L)后對發(fā)酵液中NH3-N及MCP濃度均無顯著影響。金恩望等[31]利用批次培養(yǎng)法研究植物精油對瘤胃發(fā)酵的影響,結(jié)果表明,在發(fā)酵的72 h內(nèi),添加100、500 mg/L的肉桂精油時NH3-N的濃度逐漸升高,而添加100、500、1 500 mg/L的肉桂油在發(fā)酵72 h時MCP濃度顯著升高。這些試驗結(jié)果的差異可能是由于試驗方法、發(fā)酵體系、CA的添加形式和添加水平以及發(fā)酵底物不同而引起的。另外,瘤胃中的細菌可以利用NH3-N合成MCP,降低瘤胃中NH3-N的濃度,然而,本試驗結(jié)果表明,添加不同水平的CA對發(fā)酵液中MCP濃度無顯著影響。因此推測,CA降低NH3-N的濃度是由于選擇性地抑制了瘤胃中產(chǎn)氨菌的脫氨基活性。其作用機制可能是CA的羰基與微生物酶結(jié)合使其失去作用[12]。
VFA是飼糧中碳水化合物進入瘤胃后被降解的主要產(chǎn)物,是反芻動物能量供應(yīng)的主要來源。其中乙酸、丙酸及丁酸總量占TVFA的95%以上。關(guān)于CA對瘤胃發(fā)酵時TVFA及各種VFA的濃度及比例影響的研究結(jié)果也不統(tǒng)一。Chaves等[33]研究報道,在體外發(fā)酵試驗中,添加250 mg/L的肉桂精油對TVFA、乙酸濃度無顯著影響,而丁酸濃度顯著升高;同時,Chaves等[34]在羔羊飼糧中添加CA(0.2 g/kg DM),研究其對羔羊瘤胃發(fā)酵的影響,結(jié)果表明CA增加了瘤胃液中TVFA的濃度。Busquet等[35]的體外產(chǎn)氣試驗結(jié)果表明,添加3、30、300 mg/L的肉桂油對TVFA、乙酸及丙酸濃度均無顯著影響,添加3 000 mg/L的CA能顯著降低TVFA濃度。然而,Busquet等[4]利用雙外流持續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)研究CA對瘤胃發(fā)酵的影響時發(fā)現(xiàn),添加31.2或312.0 g/L的CA使得發(fā)酵液中乙酸比例下降,丙酸及丁酸比例上升。Cardozo等[36]研究表明,添加300 mg/L的肉桂油顯著降低TVFA及支鏈脂肪酸的濃度,而添加30 mg/L的肉桂油對TVFA濃度無顯著影響。由此可見,肉桂精油及CA對TVFA濃度的影響存在明顯的劑量效應(yīng),添加低濃度的CA對TVFA濃度無顯著影響,添加高濃度CA能夠顯著降低TVFA濃度,瘤胃發(fā)酵受到抑制;另外,由于試驗方法不同,可能會對各VFA濃度及比例產(chǎn)生不同的影響。本試驗結(jié)果表明,添加不同水平的CA對發(fā)酵液中TVFA濃度以及異丁酸、異戊酸、戊酸比例無顯著影響,可能是由于本試驗所采用的CA純度較低(20%左右),不會對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用;而添加CA使得發(fā)酵液中丙酸比例顯著增加,乙酸/丙酸顯著降低,可能是由于CA抑制了甲烷菌的活性,瘤胃內(nèi)多余的H2被轉(zhuǎn)移到了丙酸合成的過程中,從而使丙酸比例增加,乙酸/丙酸降低。目前,關(guān)于CA對反芻動物瘤胃發(fā)酵的影響存在很多爭議,體外試驗和體內(nèi)試驗結(jié)果也存在一些差異,確定CA在肉羊生產(chǎn)中的最適添加量需進一步增加體內(nèi)試驗。
綜上所述,飼糧中添加200和300 mg/kg CA能夠提高肉羊飼糧中DM、CP、NDF、ADF的瘤胃有效降解率,降低發(fā)酵液中CH4和NH3-N濃度,提高發(fā)酵液中丙酸比例,并降低乙酸比例及乙酸/丙酸。在本試驗條件下,每千克飼糧中添加300 mg CA時效果最好。