曾 靜，何礎(chǔ)闊，郭建軍，袁 林,*

（1.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌 330096；2.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228）

在淀粉酶法制糖工業(yè)中，由液化轉(zhuǎn)入糖化時(shí)需要降低溫度并加酸降低糖漿的pH值。并且糖化過程中使用了多種水解酶，這些因素使得淀粉制糖的生產(chǎn)成本增加，同時(shí)降低了生產(chǎn)效率[1-4]。此外，淀粉中α-1,6-糖苷鍵不僅抵抗α-淀粉酶和β-淀粉酶的水解作用，還阻礙鄰近α-1,4-糖苷鍵的水解，從而導(dǎo)致α-(β)-極限糊精的產(chǎn)生，進(jìn)而顯著降低淀粉糖化的程度和效率[4]。若某種淀粉水解酶在液化條件下可以同時(shí)進(jìn)行糖化，則既可以省去調(diào)節(jié)pH值的過程以簡(jiǎn)化工藝、降低成本，又可以有效地防止微生物污染，并且在液化的高溫下，還可以獲得較高的反應(yīng)速率。因此，將液化過程和糖化過程合并，以便獲得一種在液化條件下具有較強(qiáng)的水解α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵能力的淀粉水解酶成為從業(yè)者亟待解決的問題。

III型普魯蘭多糖水解酶是一種雙功能淀粉水解酶，具有α-淀粉酶和普魯蘭酶的功能，可同時(shí)水解α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵[5-7]。嗜熱酸性III型普魯蘭多糖水解酶能夠在高溫的液化條件下進(jìn)行糖化作用，可使淀粉酶法制糖工業(yè)的液化過程和糖化過程合二為一，從而大大降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率[8-9]。嗜熱酸性III型普魯蘭多糖水解酶在淀粉酶法制糖流程中具有很大應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，因此有關(guān)嗜熱酸性III型普魯蘭多糖水解酶的研究已成為淀粉水解酶研究中的新熱點(diǎn)。

來源于極端嗜熱古生菌Thermococcus kodakarensisKOD1的嗜熱酸性III型普魯蘭多糖水解酶TK-PUL的酶學(xué)性質(zhì)完全符合淀粉酶法制糖工業(yè)的需求，并且已被證實(shí)可應(yīng)用于液化與糖化一步法制備麥芽糖漿[10-14]。因此，TK-PUL在淀粉酶法制糖工業(yè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。此外，TK-PUL以單一活性中心同時(shí)水解α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵的雙功能催化機(jī)制研究也具有重要理論研究?jī)r(jià)值。TK-PUL的氨基酸序列和三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，TK-PUL屬于糖苷水解酶類的第13家族（GH13_20），其由N末端結(jié)構(gòu)模塊N1（Ser18～I(xiàn)le77）、結(jié)構(gòu)模塊N2（Glu78～Phe180）、結(jié)構(gòu)模塊N（Tyr181～Glu280）和催化結(jié)構(gòu)域GH13_20（Gly281～Gly762）組成[15]。結(jié)構(gòu)模塊N與催化結(jié)構(gòu)域GH13_20緊密結(jié)合，并且經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)結(jié)構(gòu)模塊N是TK-PUL發(fā)揮催化活性所必需的（缺失結(jié)構(gòu)模塊N的突變體沒有催化活性，結(jié)果未顯示）。結(jié)構(gòu)模塊N1和結(jié)構(gòu)模塊N2與結(jié)構(gòu)模塊N和催化結(jié)構(gòu)域GH13_20的結(jié)合較為松散，這2 個(gè)結(jié)構(gòu)模塊甚至不能以晶體形式呈現(xiàn)，在TK-PUL晶體結(jié)構(gòu)中未能顯示[15]。TK-PUL中結(jié)構(gòu)模塊N1和N2屬于未知功能結(jié)構(gòu)域，其對(duì)TK-PUL酶學(xué)性質(zhì)的影響有待進(jìn)行研究。本研究通過對(duì)TK-PUL的N末端進(jìn)行截短突變，并比較TK-PUL與突變體的酶學(xué)特性，來確定N末端結(jié)構(gòu)模塊N1和N2對(duì)TK-PUL酶學(xué)性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌Escherichia coliJM109、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisRIK1285、TK-PUL表達(dá)載體pBE-S-Atkp均由本實(shí)驗(yàn)室保存；KOD-Plus-neo DNA聚合酶日本Toyobo公司；DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker 美國(guó)Fermentase公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒E.Z.N.A.美國(guó)Omega Bio-tek公司；Chelating SepharoseTMFast Flow美國(guó)GE Healthcare公司；普魯蘭糖、γ-環(huán)糊精、可溶性淀粉、玉米淀粉、糖原 美國(guó)Sigma公司；Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒、咪唑 生工生物工程（上海）股份有限公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastercycler gradient聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Eppendorf公司；TY04S-3C凝膠成像系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；SP-752PC紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)TK-PUL的基因編碼序列（Gene ID：3235344），設(shè)計(jì)本研究中構(gòu)建重組質(zhì)粒所用引物，如表1所示。以重組質(zhì)粒pBE-S-Atkp為模板，以P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得編碼突變體M1的基因Atkp-m1。PCR擴(kuò)增體系為：10×buffer I 5 μL；dNTP 5 μL；MgSO45 μL；引物各2 μL；模板1 μL；KOD-Plusneo DNA聚合酶2 μL；ddH2O 28 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，68 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)NdeI和XbaI雙酶切，連接至經(jīng)相同雙酶切處理的重組質(zhì)粒pBE-S-Atkp，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBE-S-Atkp-m1。以重組質(zhì)粒pBE-S-Atkp為模板，以P3和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得編碼突變體M3的基因Atkp-m3。重組質(zhì)粒pBES-Atkp-m3的構(gòu)建方法同上。采用NdeI和XbaI雙酶切重組質(zhì)粒，鑒定外源基因的插入情況。

采用大引物全質(zhì)粒PCR技術(shù)[16]構(gòu)建表達(dá)突變體M2的重組質(zhì)粒pBE-S-Atkp-m2。以重組質(zhì)粒pBE-S-Atkp為模板，采用突變引物P4和公用引物P5進(jìn)行大引物的擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增效果。然后再以重組質(zhì)粒pBE-S-Atkp為模板，采用上步獲得的PCR產(chǎn)物（大引物）進(jìn)行全質(zhì)粒擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶處理后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行篩選，經(jīng)測(cè)序鑒定是否為突變基因Atkp-m2。

將所得重組質(zhì)粒均送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與TK-PUL的基因序列進(jìn)行比對(duì)，確證重組質(zhì)粒中插入基因的序列正確性。

表1 構(gòu)建重組質(zhì)粒所用引物Table 1 Primer sequences used for the construction of recombinant plasmids

1.3.2 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌B. subtilisRIK1285，獲得重組枯草芽孢桿菌。B. subtilisRIK1285感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化采用改進(jìn)的Spizizen法[17]進(jìn)行。

接種重組枯草芽孢桿菌單克隆到LB液體培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶中培養(yǎng)，裝液量20 mL，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。然后轉(zhuǎn)接該培養(yǎng)物于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，用250 mL三角瓶進(jìn)行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基的裝液量為25 mL，接種量為3%，培養(yǎng)溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為48 h。待培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物于室溫12 000 r/min離心5 min，收集發(fā)酵液上清。

采用Ni2+親和層析柱對(duì)發(fā)酵上清液中目的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，用200 mmol/L咪唑緩沖液洗脫，即得到純化后的重組蛋白質(zhì)。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)重組蛋白質(zhì)的純度[18]，并采用Bradford法[18]測(cè)定重組蛋白質(zhì)的濃度。

1.3.3α-淀粉酶活性測(cè)定和普魯蘭酶活性測(cè)定

以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物，分別測(cè)定III型普魯蘭多糖水解酶的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性。將10 μL酶液（10 μg/mL）與490 μL含1 mg/mL可溶性淀粉或普魯蘭多糖的pH 4.5、50 mmol/L 4-嗎啡啉-乙烷磺酸（4-morpholineethanesulfonic acid，MES）緩沖液混合，于100 ℃反應(yīng)30 min后，迅速放入冰水浴中終止反應(yīng)，然后采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[19]測(cè)定反應(yīng)體系中還原糖量。酶活力單位（U）定義：在一定反應(yīng)條件，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.3.4 最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性測(cè)定

將酶液與不同pH值的底物（10 mg/mL的可溶性淀粉或普魯蘭多糖）混合，于100 ℃反應(yīng)30 min測(cè)定不同pH值下α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性。將所測(cè)得的最高酶活力定義為100%，并以相對(duì)酶活力對(duì)pH值作圖，確定其最適反應(yīng)pH值。采用不同緩沖液配制質(zhì)量濃度均為10 mg/mL的不同pH值的底物：50 mmol/L MES緩沖液（pH 3.0～7.0）、50 mmol/L 3-嗎啡啉-丙磺酸緩沖液（pH 7.0～9.0）。

將酶液用不同pH值（3.0～9.0）緩沖液稀釋，將其在不同pH值條件下于37 ℃處理2 h，然后用10 mg/mL的緩沖液稀釋，并根據(jù)如上反應(yīng)體系測(cè)定樣品的比活力。將未處理樣品的比活力定義為100%，計(jì)算處理后樣品的相對(duì)酶活力，并以相對(duì)酶活力對(duì)pH值作圖，評(píng)價(jià)酶的pH值穩(wěn)定性。

1.3.5 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定

按照1.3.3節(jié)中反應(yīng)體系混合酶液和底物，分別于40～110 ℃反應(yīng)30 min，測(cè)定不同溫度下α-淀粉酶活力和普魯蘭酶活力。將所測(cè)得的最高酶活力定義為100%，以相對(duì)酶活力對(duì)溫度作圖，確定其最適反應(yīng)溫度。

用50 mmol/L MES、pH 4.5緩沖液將樣品稀釋至適當(dāng)濃度，將其于100 ℃保溫，分時(shí)間梯度取出部分樣品，根據(jù)1.3.3節(jié)中反應(yīng)體系測(cè)定α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性。將未處理的酶液的酶活力定義為100%，計(jì)算樣品的相對(duì)酶活力，以相對(duì)酶活力對(duì)時(shí)間作圖，評(píng)價(jià)酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.6 動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定

用50 mmol/L MES緩沖液（pH 4.5）配制不同質(zhì)量濃度的底物（可溶性淀粉、普魯蘭多糖、γ-環(huán)糊精、玉米淀粉或糖原），分別向不同質(zhì)量濃度底物中加入6 U酶液，按照1.3.3節(jié)中反應(yīng)體系測(cè)定酶活力。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法以底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，以比活力的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，直線的斜率為Km/Vmax，截距為1/Vmax，計(jì)算米氏常數(shù)Km、最大反應(yīng)速度Vmax和反應(yīng)常數(shù)kcat?？扇苄缘矸圪|(zhì)量濃度梯度設(shè)定為5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、35.0 mg/mL；普魯蘭多糖質(zhì)量濃度梯度設(shè)定為1.6、3.2、6.4、12.8、16.0、20.0 mg/mL；γ-環(huán)糊精質(zhì)量濃度梯度設(shè)定為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mg/mL；玉米淀粉質(zhì)量濃度梯度設(shè)定為5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、35.0 mg/mL；糖原質(zhì)量濃度梯度設(shè)定為5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、35.0 mg/mL。

1.3.7 底物特異性測(cè)定

用50 mmol/L MES緩沖液（pH 4.5）將樣品稀釋至適當(dāng)濃度，分別以1 mg/mL普魯蘭多糖、γ-環(huán)糊精、可溶性淀粉、玉米淀粉、糖原為底物，于100 ℃反應(yīng)30 min后，迅速放入冰水浴中終止反應(yīng)，然后采用DNS法測(cè)定反應(yīng)體系中還原糖量，計(jì)算重組酶作用于不同底物時(shí)的比活力。將所測(cè)得的最高比活力定義為100%，計(jì)算重組酶作用于不同底物時(shí)的相對(duì)酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

酶學(xué)性質(zhì)研究實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)平行。運(yùn)用軟件SigmaPlot 12.5對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，數(shù)據(jù)均以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 N末端結(jié)構(gòu)模塊相關(guān)缺失突變體的構(gòu)建、表達(dá)與純化

TK-PUL的分子結(jié)構(gòu)顯示其由結(jié)構(gòu)模塊N1-結(jié)構(gòu)模塊N2-結(jié)構(gòu)模塊N-催化結(jié)構(gòu)域GH13_20順序連接組成（圖1A）[15]。利用NCBI網(wǎng)站的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫[20]（conserved domain database，CDD）對(duì)TK-PUL中結(jié)構(gòu)模塊N1和結(jié)構(gòu)模塊N2進(jìn)行分析，結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)模塊N1屬于未知功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)模塊N2屬于CBM48家族[21-24]。已有研究表明，糖苷水解酶中的非催化結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涞孜锾禺愋浴⒌孜锝Y(jié)合能力、底物降解能力以及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等起到重要作用，并對(duì)糖苷水解酶的催化特性顯示不同程度的影響[25]。本研究為了確定TK-PUL中未知功能結(jié)構(gòu)模塊N1和N2對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)的影響，對(duì)TK-PUL的N末端進(jìn)行截短突變，構(gòu)建了缺失結(jié)構(gòu)模塊N1的突變體M1、缺失結(jié)構(gòu)模塊N2的突變體M2以及同時(shí)缺失結(jié)構(gòu)模塊N1和N2的突變體M3，各突變體的結(jié)構(gòu)模式圖如圖1A所示。

圖1 重組蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模式圖及SDS-PAGE檢測(cè)圖Fig.1 Schematic representation and SDS-PAGE analysis of recombinant proteins

將各突變體于枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，目的蛋白質(zhì)TK-PUL、M1、M2以及M3均得到成功表達(dá)，且主要位于發(fā)酵上清液中。采用Ni2+親和層析法對(duì)發(fā)酵上清液中的目的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，得到純化后的重組蛋白質(zhì)TK-PUL、M1、M2以及M3。如圖1B所示，TK-PUL、M1、M2以及M3的表觀分子質(zhì)量分別約為84、78、72、65 kDa，大小均與理論值相符。

2.2 N末端結(jié)構(gòu)模塊相關(guān)缺失突變體的最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性

為了研究N末端結(jié)構(gòu)模塊對(duì)TK-PUL最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性的影響，本研究比較了TK-PUL及其N末端結(jié)構(gòu)模塊缺失突變體的最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性，結(jié)果如圖2、3所示。由圖2可知，以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時(shí)，TK-PUL及其N末端結(jié)構(gòu)模塊缺失突變體的最適反應(yīng)pH值均約為4.5，并且各重組酶的最適反應(yīng)pH值曲線的變化趨勢(shì)基本相同。這表明N末端結(jié)構(gòu)模塊的缺失不影響TK-PUL的最適反應(yīng)pH值。

圖2 重組酶的最適反應(yīng)pH值Fig.2 Optimal pH of recombinant enzymes

重組酶的pH值穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果顯示（圖3），不同重組酶的pH值穩(wěn)定性有明顯差異。以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時(shí)，TK-PUL和各突變體均于pH 5.5具有最高的穩(wěn)定性，TK-PUL和突變體M1具有相近的pH值穩(wěn)定性，突變體M2和M3具有相近的pH值穩(wěn)定性。其中，以可溶性淀粉為底物時(shí)，在pH 3.0～5.5的范圍內(nèi)，突變體M1的pH值穩(wěn)定性略低于TK-PUL的pH值穩(wěn)定性；在pH 5.5～9.0的范圍內(nèi)，兩者的pH值穩(wěn)定性基本一致。以普魯蘭多糖為底物時(shí)，在pH 3.0～9.0的范圍內(nèi)，突變體M1的pH值穩(wěn)定性略低于TK-PUL的pH值穩(wěn)定性。在pH 3.0～9.0的范圍內(nèi)，突變體M2和M3的pH值穩(wěn)定性明顯低于TK-PUL和突變體M1的pH值穩(wěn)定性。以上研究結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)模塊N1對(duì)TK-PUL的pH值穩(wěn)定性的影響較小，結(jié)構(gòu)模塊N2對(duì)TK-PUL維持pH值穩(wěn)定性非常重要。

綜合以上研究結(jié)果，TK-PUL中結(jié)構(gòu)模塊N1的缺失不影響TK-PUL的最適反應(yīng)pH值，并且對(duì)其pH穩(wěn)定性的影響較??；結(jié)構(gòu)模塊N2的缺失不影響TK-PUL的最適反應(yīng)pH值，但是導(dǎo)致TK-PUL的pH值穩(wěn)定性降低，即結(jié)構(gòu)模塊N2對(duì)于TK-PUL維持pH值穩(wěn)定性非常重要。據(jù)研究報(bào)道，來源于普魯蘭芽孢桿菌B. acidopullulyticus的普魯蘭酶BaPul的N末端未知功能結(jié)構(gòu)域X25和結(jié)構(gòu)域CBM41不影響其最適反應(yīng)pH值，但是結(jié)構(gòu)域X25和結(jié)構(gòu)域CBM41影響B(tài)aPul的pH值穩(wěn)定性[26]。其中結(jié)構(gòu)域X25對(duì)其維持pH值穩(wěn)定性發(fā)揮正向促進(jìn)作用，而結(jié)構(gòu)域CBM41不利于其維持pH值穩(wěn)定性。這表明，不同糖苷水解酶中類似的結(jié)構(gòu)模塊發(fā)揮不同作用，對(duì)酶學(xué)特性產(chǎn)生不同影響。

圖3 重組酶的pH值穩(wěn)定性Fig.3 pH stability of recombinant enzymes

2.3 N末端結(jié)構(gòu)模塊相關(guān)缺失突變體的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

如圖4所示，TK-PUL及各突變體具有相同的最適反應(yīng)溫度（100 ℃），但是重組酶具有不同的相對(duì)酶活力。在40～110 ℃的范圍內(nèi)，特別是70～110 ℃的范圍內(nèi)，各重組酶從大到小的相對(duì)酶活力大小依次排序?yàn)椋篗3、M2、M1、TK-PUL。該結(jié)果表明，TK-PUL及各突變體具有相同的最適反應(yīng)溫度，但是N末端結(jié)構(gòu)模塊相關(guān)缺失突變體的熱穩(wěn)定性明顯高于TK-PUL。同時(shí)，重組酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果（圖5）顯示，N末端結(jié)構(gòu)模塊相關(guān)缺失突變體于100 ℃的半衰期均長(zhǎng)于TK-PUL的半衰期。其中，100 ℃各重組酶從大到小的熱穩(wěn)定性大小依次排序?yàn)椋篗3、M2、M1、TK-PUL。TK-PUL、M1、M2、M3于100 ℃的半衰期分別約為2.00、2.30、2.50、2.55 h。與TK-PUL相比，結(jié)構(gòu)模塊N1缺失的突變體M1于100 ℃的半衰期延長(zhǎng)至TK-PUL的1.15 倍，結(jié)構(gòu)模塊N2缺失的突變體M2于100 ℃的半衰期延長(zhǎng)至TK-PUL的1.25 倍，結(jié)構(gòu)模塊N1和N2均缺失的突變體M3于100 ℃的半衰期延長(zhǎng)至TK-PUL的1.27 倍。

已有研究表明，蛋白質(zhì)分子中柔性結(jié)構(gòu)區(qū)域通常與蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，柔性結(jié)構(gòu)區(qū)域的缺失可能提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[27]。TK-PUL的N末端結(jié)構(gòu)模塊N1和N2不能在其晶體結(jié)構(gòu)中呈現(xiàn)，結(jié)構(gòu)模塊N1和N2屬于柔性結(jié)構(gòu)區(qū)域[15]。本研究中TK-PUL的結(jié)構(gòu)模塊N1和N2與其熱穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，結(jié)構(gòu)模塊N1和N2的缺失有利于TKPUL提高熱穩(wěn)定性。類似的現(xiàn)象也見于缺失位于N末端的柔性結(jié)構(gòu)域CBM41的普魯蘭酶BaPul突變體[27]和缺失位于N末端的結(jié)構(gòu)域N1的淀粉普魯蘭酶gt-apu突變體[28]。

圖4 重組酶的最適反應(yīng)溫度Fig.4 Optimal temperature of recombinant enzymes

圖5 重組酶于100 ℃的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermal stability of recombinant enzymes at 100 ℃

2.4 N末端結(jié)構(gòu)模塊相關(guān)缺失突變體的比活力和動(dòng)力學(xué)常數(shù)

本研究測(cè)定并比較了TK-PUL及其N末端結(jié)構(gòu)模塊相關(guān)缺失突變體于100 ℃以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時(shí)的比活力和動(dòng)力學(xué)常數(shù)，依此確定N末端結(jié)構(gòu)模塊N1和N2對(duì)TK-PUL的底物結(jié)合能力和底物降解能力的影響。由表2可知，與TK-PUL相比，突變體M1的α-淀粉酶比活力和普魯蘭酶比活力的比值基本不變，但是其α-淀粉酶比活力和普魯蘭酶比活力均得到提高，其中α-淀粉酶比活力提高至TK-PUL的1.11倍，普魯蘭酶比活力提高至TK-PUL的1.12 倍。另外，表3顯示，與TK-PUL相比，突變體M1以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物的Km值基本不變，kcat值明顯提高。這些結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)模塊N1的缺失不影響TK-PUL的底物結(jié)合能力，并且有利于提高其底物降解能力。

表2 TK-PUL及其突變體于100 ℃的比活力Table 2 Specific activities of TK-PUL and its mutants at 100 ℃

表3 TK-PUL及其突變體的動(dòng)力學(xué)常數(shù)（1）Table 3 Kinetic parameters for specific activities of TK-PUL and its mutants (1)

由表2可知，與TK-PUL相比，突變體M2和M3的α-淀粉酶比活力和普魯蘭酶比活力均下降，但是這2 個(gè)突變體的α-淀粉酶比活力與普魯蘭酶比活力的比值均有提高。其中突變體M2的α-淀粉酶比活力為TK-PUL的80.58%，普魯蘭酶比活力為TK-PUL的65.40%，α-淀粉酶比活力與普魯蘭酶比活力的比值為TK-PUL的1.22 倍；突變體M3的α-淀粉酶比活力為TK-PUL的84.60%，普魯蘭酶比活力為TK-PUL的70.89%，α-淀粉酶比活力與普魯蘭酶比活力的比值為TK-PUL的1.18 倍。突變體M3的比活力略高于突變體M2的比活力。由表3可知，突變體M2和M3以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時(shí)的kcat值幾乎不變，Km值明顯提高。相對(duì)于TK-PUL，突變體M2以可溶性淀粉為底物時(shí)的Km值提高至TK-PUL的1.52 倍，以普魯蘭多糖為底物時(shí)的Km值提高至TK-PUL的1.78 倍；突變體M3以可溶性淀粉為底物時(shí)的Km值提高至TK-PUL的1.47 倍，以普魯蘭多糖為底物時(shí)的Km值提高至TK-PUL的1.77 倍。即結(jié)構(gòu)模塊N2的缺失不影響TK-PUL的底物降解能力，但是導(dǎo)致其底物結(jié)合能力下降，進(jìn)而導(dǎo)致其比活力降低。

結(jié)合突變體M2和M3的α-淀粉酶比活力和普魯蘭酶比活力的比值的變化情況（即α-淀粉酶比活力的下降比率低于普魯蘭酶比活力的下降比率），以及突變體對(duì)可溶性淀粉和普魯蘭多糖的結(jié)合能力的變化情況（即對(duì)可溶性淀粉的結(jié)合能力的下降比率低于對(duì)普魯蘭多糖的結(jié)合能力的下降比率），可以得出以下結(jié)論：結(jié)構(gòu)模塊N2通過影響了TK-PUL對(duì)不同底物的親和力（即TK-PUL的底物選擇性），影響其α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性。結(jié)構(gòu)模塊N2對(duì)TK-PUL底物選擇性的影響，類似于來源于Anoxybacillussp. WB42的淀粉普魯蘭酶Pul WB42中N末端結(jié)構(gòu)域N1[29]以及來源于堿湖生菌屬Alkalilimnicolasp. NM-DCM-1的淀粉普魯蘭酶PulD7中N末端結(jié)構(gòu)域CBM48[30]對(duì)酶底物選擇性的影響。缺失結(jié)構(gòu)域N1后，Pul WB42的α-淀粉酶活性與普魯蘭酶活性的比值由83%降至18%[29]；缺失結(jié)構(gòu)域CBM48的PulD7只有α-淀粉酶活性而喪失普魯蘭酶活性[30]。

以上研究結(jié)果表明，雖然TK-PUL的N末端結(jié)構(gòu)模塊N1和N2不是其發(fā)揮催化活性所必需的結(jié)構(gòu)模塊，但是這2 個(gè)結(jié)構(gòu)模塊影響其底物降解能力和底物結(jié)合能力。缺失結(jié)構(gòu)模塊N1的突變體的底物結(jié)合能力不變，底物降解能力提高；缺失結(jié)構(gòu)模塊N2的突變體的底物降解能力不變，底物結(jié)合能力降低。

2.5 N末端結(jié)構(gòu)模塊相關(guān)缺失突變體的底物特異性

TK-PUL及其N末端結(jié)構(gòu)模塊相關(guān)缺失突變體的底物特異性測(cè)定結(jié)果顯示（表4），所有重組酶的最適反應(yīng)底物均是普魯蘭多糖。TK-PUL與突變體M1的底物特異性基本一致，即缺失結(jié)構(gòu)模塊N1不影響TK-PUL的底物特異性。與TK-PUL相比，突變體M2和M3對(duì)小分子γ-環(huán)糊精的相對(duì)酶活力略有下降，對(duì)可溶性淀粉的相對(duì)酶活力略有提高，對(duì)其他大分子底物如玉米淀粉和糖原的相對(duì)酶活力明顯下降。這表明，結(jié)構(gòu)模塊N2影響TK-PUL的底物特異性。

為了明確結(jié)構(gòu)模塊N2影響TK-PUL底物特異性的分子機(jī)制，本研究測(cè)定了TK-PUL分別以γ-環(huán)糊精、玉米淀粉、糖原為底物時(shí)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，結(jié)果如表5所示。與TK-PUL相比，突變體M2和M3以γ-環(huán)糊精為底物時(shí)的kcat值幾乎不變，Km值略有提高；以玉米淀粉或糖原為底物時(shí)的kcat值幾乎不變，Km值明顯提高。此外，表3顯示，與TK-PUL相比，突變體M2和M3以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時(shí)的kcat值幾乎不變，Km值明顯提高。其中，突變體M2和M3對(duì)可溶性淀粉的Km值的提高倍數(shù)小于突變體M2和M3對(duì)普魯蘭多糖的Km值的提高倍數(shù)，使得突變體M2和M3對(duì)可溶性淀粉的相對(duì)酶活力略有提高；突變體M2和M3對(duì)γ-環(huán)糊精、玉米淀粉或糖原的Km值的提高倍數(shù)大于突變體M2和M3對(duì)普魯蘭多糖的Km值的提高倍數(shù)，使得突變體M2和M3對(duì)這些底物的相對(duì)酶活力降低。以上結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)模塊N2通過影響酶分子對(duì)底物的結(jié)合能力，改變酶分子的底物特異性。

綜上，結(jié)構(gòu)模塊N2屬于CBM48家族。CBM家族的基本功能是結(jié)合底物、促進(jìn)催化結(jié)構(gòu)域與底物密切接觸，從而促進(jìn)底物水解[23]。例如普魯蘭酶BaPul中N末端結(jié)構(gòu)域CBM41參與酶與底物的結(jié)合，影響酶對(duì)底物的降解，從而影響其底物特異性[31]。本研究中結(jié)構(gòu)模塊N2對(duì)TKPUL底物特異性的影響與此類似。

表4 TK-PUL及其突變體的底物特異性Table 4 Substrate specificities of TK-PUL and its mutants

表5 TK-PUL及其突變體的動(dòng)力學(xué)常數(shù)（2）Table 5 Kinetic parameters for substrate specificities of TK-PUL and its mutants (2)

3 結(jié) 論

本研究對(duì)III型普魯蘭多糖水解酶TK-PUL進(jìn)行N末端截短突變，通過比較TK-PUL與突變體的酶學(xué)性質(zhì)，確定N末端結(jié)構(gòu)模塊的功能。未知功能結(jié)構(gòu)模塊N1的缺失不影響TK-PUL的最適反應(yīng)pH值、最適反應(yīng)溫度、酶的底物結(jié)合能力以及酶的底物特異性。并且結(jié)構(gòu)模塊N1的缺失提高了酶的比活力和熱穩(wěn)定性。結(jié)構(gòu)模塊N1的缺失改良了TK-PUL的催化特性，結(jié)構(gòu)模塊N1缺失突變體M1更適用于淀粉酶法制糖工業(yè)。結(jié)構(gòu)域N2的缺失提高了酶的熱穩(wěn)定性，但是降低了酶的pH值穩(wěn)定性、酶的底物結(jié)合能力以及比活力。并且結(jié)構(gòu)域N2通過影響酶對(duì)不同底物的結(jié)合能力，影響其底物選擇性，導(dǎo)致其α-淀粉酶活性與普魯蘭酶活性的比值發(fā)生變化。另外，TK-PUL中結(jié)構(gòu)模塊N1和N2均不是其發(fā)揮催化活性所必需的結(jié)構(gòu)區(qū)域。本研究揭示了TK-PUL的N末端結(jié)構(gòu)模塊與其催化特性之間的相關(guān)性，拓展了對(duì)III型普魯蘭多糖水解酶的構(gòu)效關(guān)系的了解，為其他淀粉水解酶的構(gòu)效關(guān)系和分子改造研究提供了科學(xué)依據(jù)。