趙魯杭，鄒 玲，翁登坡，廖志銀，于曉虹，霍朝霞

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

實驗教學(xué)作為現(xiàn)代大學(xué)發(fā)展水平的標(biāo)志，是一流本科課程建設(shè)的重要內(nèi)容，一流本科實驗教學(xué)課程建設(shè)的標(biāo)準(zhǔn)要具有“兩性一度”的特性，即提升高階性、突出創(chuàng)新性、增加挑戰(zhàn)度[1]，主要體現(xiàn)在實驗課程教學(xué)項目內(nèi)容的廣度和深度、實驗教學(xué)方式和手段(認知模式)的多樣性以及教學(xué)內(nèi)容綜合性、先進性、創(chuàng)新性等方面，所以做好實驗教學(xué)項目內(nèi)容的規(guī)劃和設(shè)計是非常重要的[2]。一流本科課程建設(shè)不僅僅體現(xiàn)在1～2個具體的實驗教學(xué)內(nèi)容上，而應(yīng)體現(xiàn)在整個課程教學(xué)內(nèi)容的設(shè)計理念上。

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，高?！吧锘瘜W(xué)”或“生物化學(xué)與分子生物學(xué)”等實驗課程都會涉及與蛋白質(zhì)相關(guān)的實驗教學(xué)內(nèi)容，主要內(nèi)容范圍包括：蛋白質(zhì)的提取、含量測定、分離鑒定、分子量測定、分離純化、活性檢測或功能分析以及蛋白質(zhì)(基因)表達的檢測等，不同的高校會根據(jù)各自的實驗教學(xué)條件、實驗教學(xué)大綱的規(guī)劃和要求安排相關(guān)的實驗教學(xué)內(nèi)容[3-5]。從多個院校的實驗教材和教學(xué)計劃上看，這些實驗教學(xué)內(nèi)容多是相互獨立的實驗項目，缺乏相互的關(guān)聯(lián)性，而且當(dāng)代先進實驗技術(shù)和方法的相關(guān)內(nèi)容未完全落實在學(xué)生的實驗課程學(xué)習(xí)范圍內(nèi)，這與教育部對新時代高等學(xué)校本科教育的要求是不相符合的[6]。我們在2018級～2020級的《分子醫(yī)學(xué)實驗》《生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗》等實驗課程的教學(xué)實踐中，將蛋白質(zhì)相關(guān)的實驗教學(xué)內(nèi)容整合成相互關(guān)聯(lián)的系列性、綜合性實驗教學(xué)內(nèi)容體系，并在本科生的實驗教學(xué)內(nèi)容中利用線上實驗教學(xué)資源，引入了當(dāng)代先進實驗技術(shù)和方法的實驗教學(xué)內(nèi)容，環(huán)環(huán)相扣，拓展了學(xué)生的學(xué)習(xí)空間和視野，培養(yǎng)了學(xué)生解決復(fù)雜問題的綜合能力、高級思維能力和自主創(chuàng)新性能力，取得了良好的實驗教學(xué)效果，受益的本校學(xué)生人數(shù)達2 700人。

1 蛋白質(zhì)相關(guān)系列實驗的設(shè)計框架

《分子醫(yī)學(xué)實驗》《生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗》等實驗課程中蛋白質(zhì)相關(guān)實驗教學(xué)內(nèi)容主要包括四個單元(圖1)：①組織細胞蛋白質(zhì)的提取及含量測定；②SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)及特定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量測定；③基因表達的檢測；④各種分離純化蛋白質(zhì)的層析技術(shù)和方法。這些看似相互獨立的實驗項目和內(nèi)容，實際上是一個相互關(guān)聯(lián)的系列性、綜合性實驗項目，將蛋白質(zhì)提取與含量測定、分離與相對分子量的測定、基因表達的檢測以及蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)方法等實驗安排在四個不同教學(xué)時間單元中完成，但彼此之間是相互關(guān)聯(lián)，前一個實驗為后續(xù)的實驗提供實驗材料，環(huán)環(huán)相扣。

圖1 蛋白質(zhì)相關(guān)系列性、綜合性實驗教學(xué)內(nèi)容

1.1 組織細胞蛋白質(zhì)的提取及含量測定

組織細胞中總蛋白質(zhì)的提取幾乎是所有蛋白質(zhì)相關(guān)系列實驗的第一步，通過教學(xué)講解學(xué)習(xí)各種不同生物來源的組織細胞破碎方法和蛋白質(zhì)提取方法上的差異，并進行組織蛋白質(zhì)的提取。本實驗用細胞勻漿器破碎小鼠肝臟組織細胞提取總蛋白，經(jīng)離心獲得的上清液為蛋白質(zhì)粗提液，分別用三種不同的實驗方法進行蛋白質(zhì)的含量測定，學(xué)習(xí)和掌握不同的蛋白質(zhì)含量測定方法的原理和靈敏度的差異，并將檢測的結(jié)果進行比較和分析。實驗結(jié)果表明同一種蛋白質(zhì)粗提液樣本利用不同的方法進行含量測定，所得到的實驗結(jié)果都是不一樣的，使學(xué)生了解和掌握多數(shù)蛋白質(zhì)含量測定的方法所測定的都是蛋白質(zhì)的相對含量，是相對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣本而言的，而非絕對含量。本次實驗中提取的蛋白質(zhì)一部分用于當(dāng)天蛋白質(zhì)含量測定的實驗材料，另一部分作為后續(xù)實驗材料置-20℃低溫冰箱分裝保存。

1.2 SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)及特定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量測定

在第二單元的實驗中，以上一單元提取的蛋白質(zhì)樣本為實驗材料，每個實驗小組制備兩塊SDS-PAGE凝膠，兩塊膠以同樣的方式加樣并進行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將其中的一塊膠進行考馬斯亮藍染色觀察提取蛋白質(zhì)樣本的分離情況，并測定牛血清白蛋白的相對分子質(zhì)量(見圖2)，另一塊膠做轉(zhuǎn)膜處理后4℃冰箱保存，用于第三單元的Western blot實驗。

圖2 SDS-PAGE結(jié)果圖(A：標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)Marker，B：樣本1，C：樣本2，D：牛血清白蛋白)

本單元實驗除了學(xué)習(xí)SDS-PAGE分離組織細胞蛋白質(zhì)提取物的實驗技術(shù)外，還將學(xué)習(xí)利用標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)Maker的分子量與電泳相對遷移率的函數(shù)關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定牛血清白蛋白的分子量，并通過轉(zhuǎn)膜實驗將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，作為第三單元Western blot實驗的材料。

1.3 基因表達的檢測

基因表達涉及DNA轉(zhuǎn)錄生成mRNA和mRNA翻譯生成蛋白質(zhì)兩個主要過程，檢測基因表達變化的實驗技術(shù)和方法比較多，分別可以從mRNA水平上和蛋白質(zhì)水平上對基因的表達進行檢測，這些實驗技術(shù)較為先進，體現(xiàn)了學(xué)科發(fā)展的前沿[7-8]。由于有些實驗耗時長，所要求的儀器設(shè)備復(fù)雜、昂貴，試劑消耗費用大等，所以無論是實驗時間上，還是在實驗設(shè)備和經(jīng)費條件上都不可能將所有的實驗面向本科學(xué)生進行開設(shè)。本單元線下進行Western blot實驗，將上一單元轉(zhuǎn)膜處理的PVDF膜依次進行脫脂奶粉封閉、一抗反應(yīng)、二抗反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光檢測等過程，檢測提取的蛋白質(zhì)樣本中3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH，MW 37KD)表達情況(見圖3)。線上利用虛擬仿真實驗和教學(xué)視頻等方式學(xué)習(xí)其他的基因表達檢測方法，包括：RT-PCR技術(shù)檢測mRNA表達、二維電泳實驗技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究實驗技術(shù)檢測組織細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達的整體差異和變化、流式細胞術(shù)檢測細胞表面或細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達等。

圖3 蛋白質(zhì)提取液中GAPDH的Western blot實驗結(jié)果(A：標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)Marker，B：樣本1 GAPDH 化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果，C：樣本2 GAPDH 化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果)

1.4 各種層析技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)

層析技術(shù)是化學(xué)物質(zhì)分離、純化最常用的方法，其中蛋白質(zhì)的分離純化也常用到各種層析技術(shù)和方法，如凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等[9]。由于課堂線下實驗教學(xué)的時間有限，而蛋白質(zhì)層析分離純化過程往往需要較長的時間，所以在實際實施過程中有些實驗可以降低一點實驗的復(fù)雜程度，重點放在學(xué)生學(xué)習(xí)實驗技術(shù)和方法上。如凝膠層析法分離血紅蛋白(紅色，分子量64 500)和DNP-魚精蛋白(黃色，分子量2 000-12 000)混合物(實驗)，由于分子量的不同，混合物在層析分離過程中會形成紅色和黃色的區(qū)帶，通過肉眼就可以觀察到實驗的結(jié)果。在常規(guī)常壓層析實驗的基礎(chǔ)上，引入大型儀器高效(壓)液相層析(HPLC)的演示性教學(xué)，使學(xué)生有機會學(xué)習(xí)和了解先進儀器設(shè)備在相關(guān)實驗研究中的應(yīng)用，并通過同一實驗樣品用常壓液相層析和HPLC的分離效果的比較了解不同實驗技術(shù)方法的特點和優(yōu)勢所在(圖4A、圖4B)。常壓液相凝膠過濾層析兩個蛋白峰之間未能做到基線分離，分離效果較差，分離所需時間較長，分離時間約70分鐘；凝膠過濾HPLC兩個蛋白峰之間實現(xiàn)了基線分離，分離效果和重復(fù)性好，分離所需時間較短，10分鐘即可完成樣本的分離純化過程。

圖4A 常壓液相凝膠過濾層析

圖4B 凝膠過濾HPLC

2 多種教學(xué)模式實現(xiàn)先進實驗技術(shù)教學(xué)內(nèi)容的學(xué)習(xí)

新時代高等學(xué)校本科教育的目的是培養(yǎng)有知識、能力、素質(zhì)和覺悟的新型建設(shè)性人才，培養(yǎng)學(xué)生解決復(fù)雜問題的綜合能力和高級思維能力[10]。建設(shè)一流本科課程需要突破學(xué)生的習(xí)慣性思維和認知模式，通過多種實驗教學(xué)模式，實現(xiàn)具有前沿性、時代性的先進實驗技術(shù)教學(xué)內(nèi)容的學(xué)習(xí)，體現(xiàn)實驗課程的先進性和高階性。

在基因表達的檢測這個單元的實驗教學(xué)中，由于涉及的實驗教學(xué)內(nèi)容較多，而且很多都是較為前沿的實驗技術(shù)[11-12]，我們在線下安排學(xué)生完成蛋白質(zhì)印跡實驗的基礎(chǔ)上，還安排了多個線上實驗教學(xué)內(nèi)容，并在部分教學(xué)資源缺乏的情況下，自主開發(fā)了“定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究虛擬仿真實驗教學(xué)軟件”和“流式細胞術(shù)細胞分型虛擬仿真實驗教學(xué)軟件”，將線上學(xué)習(xí)的成績計入實驗課程的總成績。蛋白質(zhì)組學(xué)研究是后基因組時代的重要研究內(nèi)容之一，也是整個生命科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛的先進實驗技術(shù)和方法，可以一次性比較多種不同生物樣本中表達的所有蛋白質(zhì)的質(zhì)和量的變化和差異[13-14]。但是因為該技術(shù)需要使用一些大型的儀器設(shè)備(色譜儀、液質(zhì)聯(lián)用儀)、實驗過程耗時長、實驗試劑昂貴等原因，在本科生的實驗中是不可能開展此實驗項目[15]。在國內(nèi)率先將蛋白質(zhì)組學(xué)研究實驗技術(shù)應(yīng)用于本科生的實驗教學(xué)中，“定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究虛擬仿真實驗”利用現(xiàn)代數(shù)字信息技術(shù)，通過虛擬的實驗場景和虛擬的操作過程，完成了臨床真實案例引導(dǎo)的虛擬實驗研究(PBL實驗教學(xué)模式)，并對真實的實驗結(jié)果進行了分析，將先進的基礎(chǔ)研究實驗技術(shù)與解決臨床問題相結(jié)合，虛實結(jié)合，解決了一流實驗課程教學(xué)內(nèi)容中非常有必要，但現(xiàn)實實驗教學(xué)中卻難以開展的實驗教學(xué)項目。

HPLC是在高壓的狀態(tài)下進行層析的一種實驗方法，與常壓層析實驗相比具有分離速度快、分辨率高、實驗重復(fù)性好等特點，但由于HPLC儀是一種大型的精密儀器，實驗前準(zhǔn)備和維護保養(yǎng)的要求較高，所以利用教學(xué)演示的方法對混合蛋白質(zhì)樣本進行HPLC分離檢測，并將實驗結(jié)果與常壓狀態(tài)下的層析實驗進行對比(圖4A、圖4B)，這樣學(xué)生不但可以學(xué)習(xí)HPLC的工作原理，也能更好地了解HPLC的技術(shù)特點和優(yōu)勢。

3 結(jié)語

將一個完整的蛋白質(zhì)提取、含量測定、分離鑒定、分子量測定、分離純化、活性檢測或功能分析以及蛋白質(zhì)(基因)表達的檢測等生化大實驗設(shè)計成4個系列性、綜合性實驗，實驗與實驗之間教學(xué)內(nèi)容環(huán)環(huán)相扣，可以讓學(xué)生理解和掌握每個實驗的相對獨立性以及實驗之間的相互關(guān)聯(lián)性，培養(yǎng)了學(xué)生的整體觀，這樣既可以解決長時段實驗時間安排困難的問題，又能解決學(xué)生知識學(xué)習(xí)的完整性問題。線上線下混合式教學(xué)方式拓展了學(xué)生的學(xué)習(xí)空間，解決了現(xiàn)實實驗條件下難以完成的先進實驗技術(shù)的學(xué)習(xí)和體驗的問題，強化了現(xiàn)代信息技術(shù)與教育教學(xué)的深度融合，解決了教學(xué)模式創(chuàng)新的問題?；谂R床科學(xué)問題的PBL教學(xué)模式將先進的實驗技術(shù)與臨床研究相結(jié)合，培養(yǎng)了學(xué)生的科研能力和創(chuàng)新性思維能力。線上學(xué)習(xí)成績納入整個課程的考核評價體系，結(jié)合整個實驗課程后續(xù)的自主探究性、創(chuàng)新性實驗部分，提升了課程學(xué)習(xí)的廣度和深度，增加了課程學(xué)習(xí)的難度和挑戰(zhàn)性。