陳 雅，徐 苗，王欣宜，單欣荷，季琳凱，張擁軍

（中國計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018）

黑木耳（Auricularia auricula）隸屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）木耳目（Auriculariales）木耳科（Auriculariaceae）木耳屬（Auricularia），為中國珍貴的藥用和食用菌，早在19世紀(jì)，黑木耳就被用于民間醫(yī)藥，用于治療咽喉痛、眼痛、黃疸等病癥，并作為收斂劑[1-2]。黑木耳子實(shí)體是一種棕黑色的高碳水化合物含量（630 g/kg干燥子實(shí)體）的膠質(zhì)菌[3]，是人類食用的第4種最重要的人工栽培蘑菇[4]，含多種人體不可缺少的營養(yǎng)成分[5]。

中國是黑木耳的主要生產(chǎn)國，年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的90%以上，2017年中國黑木耳總產(chǎn)量已達(dá)638.84萬噸，其市場潛力十分巨大。黑木耳黑色素安全性極高，且具有自由基清除能力、防紫外線、增強(qiáng)人體免疫功能等保健作用[6-8]，是極具發(fā)展?jié)摿Φ奶烊还δ苄灾珓?/p>

1 黑木耳黑色素的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)表征

黑木耳子實(shí)體呈現(xiàn)黑褐色是因其富含的黑色素。黑色素是已知的生物色素中分布最廣，含量最多的一類色素，由吲哚與酚類化合物氧化聚合而成[9，10]。黑色素分為真黑色素（含氮不含硫原子，黑色或棕色）、棕黑色素（含氮和硫原子，棕黑色、黃棕色或棕色）和異黑色素（黑色或棕色）3類[11，12]。真黑色素與棕黑色素的分子結(jié)構(gòu)如圖1所示，異黑色素由多酚氧化聚合而成，目前其具體的合成途徑與結(jié)構(gòu)尚不明確[13]。

圖1 黑色素分子結(jié)構(gòu)（左：真黑色素；右：棕黑色素）Figure 1 The molecular structure of melanin(left:eumelanin;right:pheomelanin)

黑色素的生物合成主要包括黑色素細(xì)胞遷移分裂、黑色素小體形成與黑色素合成、黑色素顆粒轉(zhuǎn)運(yùn)及黑色素排泄等過程[14，15]。合成過程主要涉及3種因素：底物酪氨酸、酪氨酸酶與參與催化的氧元素。

不同來源的黑木耳黑色素結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相似，易溶于堿性溶液以及甲醇、丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑，不溶于乙醚，溶解度隨pH降低而減小，pH小于2.0時(shí)該色素基本上全部沉淀；具有一定耐熱性和耐光性，對氧化劑和還原劑不穩(wěn)定；金屬離子Cu2+和Zn2+會使該色素產(chǎn)生沉淀，而Ca2+、Mg2+、K+和Na+對該色素的影響不明顯[16]。其掃描電鏡圖像顯示其為大塊無定形物質(zhì)，缺乏晶體結(jié)構(gòu)[17]。

黑木耳黑色素具有均勻性，其組成與單體單元和聚合過程中的環(huán)境條件等因素有關(guān)。如何長川研究發(fā)現(xiàn)黑木耳黑色素中硫元素含量為0.54 g/100g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于9 g/100g 的棕黑素中硫元素含量；氮元素含量為11.00 g/100g，略高于真黑素中氮元素的含量9 g/100g，基本符合真黑素中硫、氮元素的含量范圍且與真黑色素結(jié)構(gòu)特征基本相符[12]。李琦研究發(fā)現(xiàn)黑木耳黑色素N 元素含量為6.85%，含有S 原子和羧基、酚羥基、甲基、胺基、羰基等官能團(tuán)，將其鑒定為棕黑色素[13]。侯若琳采用紫外-可見分光光度法（UV-Vis）、傅立葉變換紅外光譜法（FT-IR）、元素分析、高效液相色譜法（HPLC）、核磁共振（NMR）分析手段，發(fā)現(xiàn)黑木耳黑色素平均分子量為48.99 kDa，分子中具有吲哚結(jié)構(gòu)，符合真黑色素的典型特征[18]。Zou等從黑木耳子實(shí)體分離出黑色素I 與黑色素II 兩種組分，分子量分別為384 kDa 與47 kDa，而黑色素粗提物主要成分是褐黑色素（pheomelanin），與黑色素I及II具有相同的溶解性和光譜性質(zhì)，與黑色素II的L*、A*和B*值均高于黑色素I[19]。

近年來對發(fā)酵法獲得的黑木耳黑色素的分子組成與結(jié)構(gòu)的研究也有較大進(jìn)展。如張曉娟發(fā)現(xiàn)發(fā)酵法獲得的黑木耳黑色素含有酚羥基、羧基、氨基、羰基等官能團(tuán)，初步推斷其為真黑色素和棕黑色素的混合物，并以真黑色素為主[15]。鄒宇等采用液體發(fā)酵、Sephadex G-100色譜分離獲得兩種黑木耳黑色素F1和F2，分子量分別為404.97 kDa和20.69 kDa，均含有C、N、O、H、S元素和酚羥基、胺基、羰基、乙烯基、次亞甲基、亞甲基及芳香族基團(tuán)，屬于棕黑色素[20]。Sun等通過紫外-可見分光光度法（UV-Vis）、高效液相色譜法（HPLC）、傅立葉變換紅外光譜法（FT-IR）、核磁共振（NMR）和元素分析法，確定發(fā)酵法獲得的黑木耳黑色素分子式的結(jié)構(gòu)單元為[C18（OR）3H7O4N2]n，是一種真黑色素，也是5，6-二羥基吲哚和5，6-二羥基吲哚-2-羧酸的大分子聚合物[2]，其分子結(jié)構(gòu)如圖2。

圖2 黑木耳黑色素的部分聚合物鏈結(jié)構(gòu)Figure 2 Partial polymer chain structure of melanin from Auricularia auricula

綜上，黑木耳黑色素溶于堿性溶液及極性溶劑，不溶于酸性溶液及弱極性與非極性溶劑，對光和熱有較好的穩(wěn)定性。通過菌種發(fā)酵獲得的黑木耳黑色素為真黑色素與棕黑色素的混合物；而從黑木耳子實(shí)體中提取制備的黑色素主要為棕黑色素或真黑色素，這可能與黑木耳不同產(chǎn)地品種間的差異有關(guān)。

2 黑木耳中黑色素含量的影響因素

2.1 發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分對黑木耳黑色素產(chǎn)量的影響

黑木耳菌株發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，發(fā)酵環(huán)境中鹽對黑木耳菌株的生長與黑色素產(chǎn)量有一定影響。如宋丹靚敏等研究發(fā)現(xiàn)，濃度為0.5 g/L的Zn（CH3COO）2與CuSO4能抑制黑木耳菌絲生長；CaCl2可增加發(fā)酵過程中黑木耳的生物量；Zn（CH3COO）2與CaCl2可增加黑木耳菌株的黑色素產(chǎn)量[21]。另外，發(fā)酵液中的脂肪酸對黑木耳黑色素產(chǎn)量亦有影響。如武志超發(fā)現(xiàn)，黑木耳菌株發(fā)酵過程中，硬脂酸、油酸、亞油酸與棕櫚酸的添加量在0.1%～1.0%時(shí)，對黑木耳黑色素的積累起促進(jìn)作用，其中，硬脂酸添加量為1.0%時(shí)，黑色素產(chǎn)量達(dá)0.82±0.66 mg/mL，是對照組的1.49倍；油酸添加量為1.0%時(shí)，黑色素產(chǎn)量達(dá)0.87±0.71 mg/mL，是對照組的1.58倍[22]。

2.2 替代料及栽培條件對黑木耳黑色素產(chǎn)量的影響

么宏偉分別采用闊葉木屑、玉米秸稈、玉米芯等替代料，以及野生、棚栽、林下地栽與地栽等不同種栽培方式培養(yǎng)黑木耳，發(fā)現(xiàn)替代料基質(zhì)可增加黑木耳中粗多糖、黑色素等功能性成分的含量，減少粗脂肪及鋅、鎂、鐵等礦質(zhì)元素的積累；栽培模式可顯著影響黑木耳中常量營養(yǎng)和功能性成分，其中，添加闊葉木屑、玉米秸稈與玉米芯均可顯著增加黑木耳黑色素的產(chǎn)量，降低膠狀物質(zhì)的積累[23]。

3 黑木耳黑色素的分離制備

3.1 黑木耳子實(shí)體黑色素的提取

黑色素的制備大多是利用其堿溶酸沉的性質(zhì)，且酸沉過程中還可以利用酸的水解作用去除體系中的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)。黑木耳作為擔(dān)子菌亞門真菌，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同于植物細(xì)胞壁，其細(xì)胞壁是排列在細(xì)胞質(zhì)膜表面的多孔高分子復(fù)合物，含有抗應(yīng)力的幾丁質(zhì)微纖維、線性葡萄糖聚合物或葡聚糖以及多種細(xì)胞壁蛋白，這種結(jié)構(gòu)使得黑木耳細(xì)胞壁的壁層厚且質(zhì)地異常堅(jiān)韌，其破碎難度遠(yuǎn)大于植物。為增加黑木耳黑色素的溶出，大部分溶劑提取法還會輔助超聲波技術(shù)或微波技術(shù)。超聲波提取技術(shù)是利用超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械傳質(zhì)效應(yīng)和熱效應(yīng)，提高細(xì)胞內(nèi)容物的穿透力和傳輸能力，增大物質(zhì)分子運(yùn)動頻率和速度，提高有效成分的浸出率。微波提取技術(shù)是利用微波的穿透性加熱。另外，由于纖維素酶（多種水解酶組成的復(fù)合酶系）可有效破壞細(xì)胞壁，提高細(xì)胞壁內(nèi)活性物質(zhì)的提取效率，亦在食藥用菌活性物質(zhì)提取中得到廣泛應(yīng)用。黑木耳子實(shí)體中黑色素常見的提取方法見下表1[24-32]。常規(guī)的堿法提?。ǔＳ肗aOH作為提取溶劑）或酸法提取（常用HCl作為提取溶劑）操作簡便，但黑木耳黑色素的得率不高（在3%以下）。在常規(guī)提取基礎(chǔ)上，輔助超聲、微波等機(jī)械手段或機(jī)械手段與生物酶法協(xié)同處理，可使黑木耳黑色素的提取得率明顯提高。如黑木耳子實(shí)體在NaOH堿提、高溫高壓、液氮研磨處理后，再采用超聲波浸提的方式，黑木耳黑色素的提取得率可達(dá)到9.107%[25]。超聲輔助NaOH 的提取方式，黑木耳黑色素的提取得率比傳統(tǒng)溶劑法的提取率高26.94%[26]。微波輔助NaOH堿提，并加入95%乙醇（與NaOH體積比3∶13），黑木耳黑色素的提取得率可達(dá)到35.17%[28]。超聲輔助Na2CO3的提取方式能使黑木耳黑色素的提取得率達(dá)到9.08%[30]。而通過纖維素酶對黑木耳子實(shí)體處理120 min后，再采用超聲輔助NaOH的提取方式，可使黑木耳黑色素的提取得率達(dá)到10.48%[32]。

表1 黑木耳子實(shí)體中黑色素的提取方法Table 1 Extraction methods of melanin from Auricularia auricula fruit body

3.2 黑木耳黑色素的發(fā)酵法制備

針對黑木耳子實(shí)體生長周期長的特點(diǎn)，液體深層發(fā)酵法具有周期短、成本低、便于分離純化等優(yōu)勢，近年來這方面的研究已引起關(guān)注，相關(guān)研究見表2[11，16，33-35]。采用發(fā)酵法制備黑木耳黑色素，發(fā)酵液的營養(yǎng)控制對于促進(jìn)黑色素的產(chǎn)生非常重要。如Sun等研究發(fā)現(xiàn)，酵母提取物、酪氨酸和乳糖對黑木耳黑色素的產(chǎn)生有顯著影響，在低碳和無碳培養(yǎng)基中黑木耳菌絲生長速率最高,而在低氮和無氮培養(yǎng)基中，黑木耳黑色素產(chǎn)量很低；酪氨酸能促進(jìn)黑木耳黑色素的合成，培養(yǎng)基中酪氨酸缺乏導(dǎo)致黑木耳黑色素分泌減弱，無機(jī)鹽對菌絲形態(tài)有顯著影響，但對菌絲生長速率和黑木耳黑色素產(chǎn)量無明顯影響[33]。由表2，通過優(yōu)化發(fā)酵條件，黑木耳黑色素的產(chǎn)率在1 g/L以上，產(chǎn)率高的接近3 g/L，且發(fā)酵生產(chǎn)不受場地、氣候限制，發(fā)酵條件易于控制，是一種很有前景的黑木耳黑色素生產(chǎn)方式。

表2 黑木耳黑色素的液體深層發(fā)酵法制備Table 2 Preparation of melanin from Auricularia auricula by submerged fermentation

綜上，關(guān)于黑木耳黑色素的分離制備方面的研究已不斷開展，每種方法各有其自身的特點(diǎn)，不同方法獲得的黑木耳黑色素得率亦各不相同。由于從黑木耳中分離提取的黑色素還含有其它雜質(zhì)從而影響其穩(wěn)定性、生物活性及在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用，需進(jìn)一步分離純化。目前，大多采用化學(xué)方法（如熱鹽酸）或色譜法來純化黑色素，以提高其高品質(zhì)及進(jìn)一步的分子結(jié)構(gòu)研究。

4 黑木耳黑色素生物活性和功能特性

黑色素有許多重要的生物學(xué)功能，如黑色素得益于蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用而能提供一些機(jī)械力并且保護(hù)蛋白質(zhì)不被降解；黑色素形成過程中正醌的產(chǎn)生具有進(jìn)化上的重要性，特別是那些親核性的基團(tuán)，如氨基（-NH2）和巰基（-SH），可使其獲得抗生素特性；黑色素光吸收和光衍射的特性被利用在光受體的屏蔽上并被認(rèn)為對爬行動物體溫調(diào)節(jié)具有一定的作用等等[36]。

4.1 黑木耳黑色素清除自由基能力

自由基是一類高活性物質(zhì)，含有未配對電子。自由基具有強(qiáng)氧化性，有極為活潑的反應(yīng)性，能和各種細(xì)胞成分（膜磷脂、蛋白、核酸）發(fā)生反應(yīng)，使膜的基本特性如變構(gòu)、離子傳遞、酶活性等發(fā)生改變[37]。在機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡失調(diào)的情況下，體內(nèi)過量自由基的產(chǎn)生與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展及有機(jī)體的衰老過程密切相關(guān)，是人體產(chǎn)生疾病的主要原因。由于自由基與人體疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此攝入具有清除自由基能力的物質(zhì)成為抵御自由基危害的重要途徑。

天然黑色素的抗氧化能力主要表現(xiàn)為清除OH·、O2-·、DPPH·、ABTS+·、抑制脂質(zhì)過氧化及具有還原力等方面[32]。黑色素清除自由基的機(jī)制一方面是其可在多聚物鄰苯二酚和醌之間的電子離域產(chǎn)生大量半醌自由基，使其表現(xiàn)出顯著的氧化還原性；另一方面是其具有很強(qiáng)的陽離子螯合特性，可通過羧基和羥基等陰離子起作用，阻止磷脂脂質(zhì)體的氧化[25]。

黑木耳子實(shí)體與發(fā)酵法獲得的黑色素均具有清除自由基能力。如張蓮姬發(fā)現(xiàn)黑木耳子實(shí)體中黑色素可明顯抑制小鼠正常肝勻漿的肝細(xì)胞脂質(zhì)及蛋黃脂質(zhì)的過氧化，其半抑制率濃度分別為0.065 mg/mL與0.110 mg/mL；黑木耳黑色素對OH·的半抑制率濃度為0.48 mg/L，對DPPH·的半抑制率濃度為0.176 mg/mL[38]。鄒宇等通過發(fā)酵法制備的黑木耳黑色素F1和F2，濃度為1.0 mg/mL時(shí)均對O2-·清除率均超過80%，對OH·清除率均接近40%[39]。張敏等通過發(fā)酵法制備的黑木耳黑色素，當(dāng)濃度為50 mg/mL 時(shí)，對ABTS+的清除率為97.69%，效果優(yōu)于同濃度的Vc；當(dāng)濃度為100 mg/mL時(shí)，對O2-·的清除率超過85%，效果優(yōu)于同濃度的Vc[40]。上述研究表明，黑木耳子實(shí)體與發(fā)酵法制備的黑色素對O2-·、DPPH·、OH·、ABTS+、過氧化氫等均具有明顯的清除效果，甚至優(yōu)于同濃度的Vc及人工合成抗氧化劑BHT，同時(shí)動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)亦表明黑木耳黑色素對小鼠脂質(zhì)過氧化能力具有較好地抑制作用，作為功能色素具有極大的開發(fā)潛力與應(yīng)用價(jià)值。

4.2 黑木耳黑色素抑菌抗病毒能力

黑木耳黑色素具有一定的抑菌抗病毒能力，如Li等通過實(shí)驗(yàn)證明純化的黑木耳黑色素對細(xì)菌群體感應(yīng)調(diào)控行為有顯著抑制作用，且黑木耳黑色素在80 μg/mL時(shí)，對腸埃希氏菌K-12、銅綠假單胞菌PAO1和熒光假單胞菌P-3的生物膜形成抑制率分別是71.3%、61.7%和63.2%[41]。

4.3 黑木耳黑色素的抗輻射能力

黑色素作為目前所知唯一具有保護(hù)皮膚免受輻射傷害的天然聚合體，具有抗x射線、γ射線、宇宙射線、核輻射等多種輻射的作用，并能大量吸收可見與紫外光，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受損傷。黑色素的抗輻射能力分為物理保護(hù)與化學(xué)保護(hù)：前者是通過吸收或散射等方式阻擋外來輻射；后者是通過黑色素清除光誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基，而使機(jī)體免受輻射傷害。Menter 等研究發(fā)現(xiàn)，黑色素在溶液中的電子轉(zhuǎn)移和光保護(hù)特性證明黑色素作為紫外線吸收劑可有效避免紫外輻射對核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的傷害[42]。

4.4 黑木耳黑色素改善肝損傷能力

肝臟作為人體重要的代謝和解毒器官，在糖類、脂肪、蛋白質(zhì)代謝中起重要作用，其病變將會影響正常的新陳代謝。研究表明，大部分肝臟疾病如肝炎、肝硬化等的發(fā)生和發(fā)展都與氧化應(yīng)激有關(guān)。劉城移等以四氯化碳致小鼠急性肝損傷為模型，通過血清酶指標(biāo)、肝功指標(biāo)的變化及病理切片，證明黑木耳黑色素能通過清除肝內(nèi)過量自由基，增強(qiáng)肝內(nèi)抗氧化酶活力，起到保護(hù)肝臟抗氧化系統(tǒng)的作用[43]。Hou等為探討黑木耳中的天然黑色素對急性酒精性肝損傷小鼠的保肝作用，在乙醇致小鼠肝損傷前給予黑木耳黑色素，每日1次，連續(xù)3周，比較黑色素組和對照組小鼠肝功能生化指標(biāo)、組織病理切片、抗氧化酶mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，黑木耳黑色素對乙醇性肝損傷具有保護(hù)作用，可顯著降低小鼠肝臟指數(shù)、血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）和肝臟丙二醛（MDA）水平，增加肝臟乙醇脫氫酶（ADH）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）水平；其保護(hù)作用可能與核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）及其下游抗氧化酶如谷氨酸半胱氨酸連接酶催化（GCLC）、谷氨酸半胱氨酸連接酶修飾劑（GCLM）和NADP（H）奎寧氧化還原酶1（NQO-1）的激活有關(guān)，提示黑木耳黑色素可能成為減輕酒精性肝損傷的有效策略[44]。

4.5 黑木耳黑色素保護(hù)DNA能力

活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）自由基是引起DNA氧化損傷的重要因素，黑色素對DNA的氧化損傷具有保護(hù)作用。Shcherba等研究發(fā)現(xiàn)，黑色素具有強(qiáng)抗氧化活性，極低濃度就可以防止過氧化物酶介導(dǎo)的氨基聯(lián)苯降解產(chǎn)物對噬菌體-脫氧核糖核酸的破壞[45]。

5 結(jié)論

近些年，關(guān)于黑木耳黑色素的分離制備及其生物活性的研究已成為食品科學(xué)研究的熱點(diǎn)。黑木耳是我國一種分布極為廣泛且具有獨(dú)特的營養(yǎng)價(jià)值與保健功能的食用菌，對于黑木耳相關(guān)性質(zhì)的研究一直在進(jìn)行，但在以下方面仍待深入與完善：（1）黑木耳黑色素提取的原料主要是黑木耳子實(shí)體，但黑木耳生產(chǎn)周期長，勞動強(qiáng)度大，產(chǎn)量和品質(zhì)易受影響等問題，限制了黑木耳黑色素的研究以及應(yīng)用。（2）黑木耳黑色素的提取難度高且得率低，嚴(yán)重制約黑木耳黑色素的研究和發(fā)展。要提高黑木耳黑色素的得率，必須綜合使用化學(xué)方法、生物方法和現(xiàn)代儀器分析方法，不斷探究黑木耳黑色素的綠色高效制備工藝。（3）黑木耳黑色素清除自由基作用機(jī)制方面的研究鮮有報(bào)道，其抗氧化應(yīng)激的信號傳導(dǎo)途徑也未曾明確。（4）黑木耳黑色素分子結(jié)構(gòu)尚不清楚，需進(jìn)一步深入研究。故黑木耳黑色素的高效分離制備、分子結(jié)構(gòu)及其清除自由基的作用機(jī)制研究仍有很大的拓展空間，其發(fā)展前景不容小覷。