孫文秀

（凌源市中心醫(yī)院耳鼻喉科，遼寧 朝陽122500）

鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤（NIP）是耳鼻喉科常見的臨床上常見的一種良性腫瘤，中年男性為高發(fā)群體，發(fā)病率僅次于鼻部血管瘤，在鼻腔腫瘤中約占5%[1]。NIP病理特點表現(xiàn)為表層上皮呈分支狀或乳頭狀過度增生，其細胞增殖的活性水平較高[2]。NIP具有惡性腫瘤的侵襲性及破壞性行為，極易復發(fā)或惡變?yōu)榘┌Y，因此，又被歸屬于交界性腫瘤，即癌前病變，且多惡變?yōu)轺[狀細胞癌[3]。隨著鼻內(nèi)鏡手術技術的不斷提高，NIP的治愈率也明顯提高，但其復發(fā)及惡變率仍較高[4]。肽基脯氨酰異構酶1（Pin1）是一種具有特異性功能的高度保守蛋白，主要調節(jié)有絲分裂相關蛋白酶[5]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種高度封閉的蛋白激酶，可調節(jié)細胞代謝[6]。Pin1和mTOR在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中的具有重要作用，但關于Pin1和mTOR在NIP表達的研究目前尚無相關報道，本研究旨在檢測Pin1和mTOR在NIP組織中的表達情況，以探討Pin1與mTOR表達的關系及其在NIP惡變中的作用，以期為NIP診斷治療和預后提供新的理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年4至2018年6月本院收治的NIP患者（NIP組，n=81）和同期正常下鼻甲黏膜患者（正常下鼻甲黏膜組，n=60）作為研究對象。NIP組男59例，女22例；年齡40～75歲，平均年齡（57.36±7.49）歲。正常下鼻甲黏膜組男42例，女18例；年齡40～78歲，平均年齡（57.85±7.58）歲。兩組臨床資料比較差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。所有患者均對本研究知情同意，并自愿簽署知情同意書。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審核批準。納入標準：①符合NIP診斷標準并確診[7]；②患者年齡＞18歲；③簽署知情同意書。排除標準：①既往存在慢性鼻鼻竇炎病史者；②既往存在變態(tài)反應病史者。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 主要儀器：切片機（德國LEICA公司）、光學顯微鏡（日本Olympus公司）、低溫冰箱（韓電公司）、恒溫箱（武漢醫(yī)療儀器廠）；主要試劑：鼠抗人Pin1克隆抗體（青島捷世康生物科技有限公司）、鼠抗人mTOR單克隆抗體[微蒙（上海）生物科技有限公司）、濃縮型兔抗人CyclinD1單克隆抗體、DBA試劑盒及S-P超敏免疫組化試劑盒均由上海萬疆生物技術有限公司提供。

1.2.2 檢測Pin1和mTOR蛋白表達 采用免疫組織化學方法檢測病理組織標本中Pin1和mTOR蛋白表達，采用切片機將石蠟包埋組織切成4 μm厚度，并置入60℃恒溫箱烤片30 min，取出自然冷卻晾置30 min，二甲苯脫蠟（40 min）后，依次放入100%、95%、80%及75%的乙醇中各10 min，PBS洗滌3次（每次5 min），蒸餾水浸泡5 min后加入3%過氧化氫溶液50 μL，在恒溫箱（20℃）孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活，PBS沖洗3次（每次5 min），加入50 μL的一抗（1:100）過夜（4℃），加入二抗孵育10 min（20℃），采用DBA試劑盒中的試劑進行顯色，放入顯微鏡下觀察，顯色后用蒸餾水洗掉，終止顯色，蘇木素復染2 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 觀察指標及評價標準Pin1蛋白及mTOR蛋白顯色后，呈黃色或棕黃色則為陽性。隨機抽取每張切片的10個視野（×400），按陽性細胞所占的百分率和著色深淺進行結果判定。陽性細胞百分比評分（PP）標準：①0分，陽細胞＜25%；②1分，25%≤陽性細胞百分比≤50%；③2分，50%＜陽性細胞百分比≤75%；④3分，陽性細胞百分比＞75%。染色強度評分（SI）標準：①0分，無染色；②1分，淡黃色；②2分，棕黃色；③3分，棕褐色。按照公式：免疫反應評分（IRS）=PP×SI，并將IRS＞1分判斷為陽性表達[8]。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組Pin1和mTOR蛋白表達情況比較NIP組Pin1和mTOR蛋白陽性表達率分別為72.84%、79.01%，均明顯高于正常下鼻甲黏膜組表達率（1.67%、6.67%），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Pin1蛋白主要在細胞核中表達，呈黃色至棕色，mTOR蛋白主要在胞漿中表達，呈黃色至棕褐色，見表1、圖1。

表1 兩組Pin1和mTOR蛋白表達情況比較[n（%）]Table 1 Comparison of Pin1 and mTOR protein expression between the two groups[n(%)]

圖1 Pin1和mTOR蛋白表達情況Figure 1 Protein expression of Pin1 and mTOR

2.2 Pin1和mTOR蛋白在NIP中表達的相關性分析 經(jīng)Spearman相關性分析顯示，在NIP中Pin1和mTOR蛋白表達呈正相關性（r=0.624，P=0.000）。

3 討論

NIP是常見的鼻腔鼻竇的良性腫瘤，在所有鼻部乳頭狀瘤中約占75%[9]。目前NIP的發(fā)病機制尚未明確，通常認為人類乳頭狀瘤病毒（HPV）感染是NIP發(fā)病的主要原因之一，尤其是高危型HPV與其復發(fā)及惡化密切相關，此外變態(tài)反應、慢性炎癥、環(huán)境因素等也是高危影響因素[10]。NIP具有特殊的臨床特點及病理學特征，即對周圍組織結構具有局部侵襲性，多中心生長及轉移，且發(fā)展迅速，少數(shù)伴有惡變傾向，因此，局部交界性腫瘤的特點[11]。目前對于NIP惡變的機制尚未明確，需進一步深入研究。隨著腫瘤分子生物學的不斷發(fā)展，腫瘤相關的因子指標對NIP的發(fā)生、發(fā)展和預后有著重要的指導意義。

Pin1于20世紀90年代首次被發(fā)現(xiàn)，屬于多膚基脯氨酸順反同分異構酶家族，直接影響蛋白功能活性，對細胞的有絲分裂具有重要調節(jié)作用[12]。相關研究顯示[13]，Pin1在多種惡性腫瘤中，尤其在鱗癌中存在過表達，并對腫瘤的發(fā)生及發(fā)展起重要作用。Pin1會激活JNK活化c-jun及協(xié)同Ras信號傳導通路，從而促進CyclinD1的轉錄，且阻止Cyc11nD1從胞核移至胞漿降解，進而使細胞周期紊亂，導致腫瘤發(fā)生，且敲除Pin1后，會導致癌細胞凋亡[14]。本研究結果顯示，NIP組Pin1蛋白陽性率高于正常下鼻甲黏膜組（P＜0.05），原因為正常狀態(tài)下，Pin1通常呈低表達，當細胞惡變后，其表達上調，并導致細胞周期發(fā)生紊亂，細胞增殖速度加快，促使腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在NIP中Pin1參與腫瘤細胞的有絲分裂，并可能造成細胞周期出現(xiàn)紊亂，腫瘤細胞增殖加速，惡變風險增高。

mTOR最早在20世紀90年代初被發(fā)現(xiàn)，屬于磷酸肌醇3-激酶相關蛋白激酶家族成員，是一種位于PI3K/PKB信號蛋白通路下游的靶蛋白[15]。相關研究證實[16]，mTOR在多種惡性腫瘤細胞中存在異常表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，直接或間接控制細胞的生長、增殖及遷移等生物過程。本研究結果顯示，NIP組mTOR蛋白陽性率高于正常下鼻甲黏膜組（P＜0.05），這可能是因為mTOR的過度表達會上調CyclinDl蛋白的表達，從而導致細胞生長周期發(fā)生紊亂，并可加速細胞的惡變。

本研究結果顯示，在NIP中Pin1和mTOR蛋白表達呈正相關性，原因為Pin1具有調節(jié)細胞有絲分裂的功能，可與大部分酶類產(chǎn)生相互作用，加快細胞的轉化與增殖[17]。mTOR屬于一種不典型蛋白激酶，參與細胞增殖、遷移和細胞周期調控，調控細胞生長調節(jié)的核心歩驟，可與Pin1產(chǎn)生相互作用，在細胞周期中對細胞生長有重要作用，且兩者有一個共同的下游底物，即CyclinDl，從而在腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用，并可能是惡性細胞發(fā)生的重要因素，在NIP發(fā)生惡變的過程中起重要作用[18]。

綜上所述，Pin1和mTOR蛋白在NIP中高表達，通過有效抑制兩者的過表達，可能有望成為NIP靶點治療的新方向。