陳立杰　杜巧麗　陳美晴　謝鑫

摘 要 在生物功能研究過程中，通常需要從混合蛋白中區(qū)分、檢測目標(biāo)靶蛋白，而蛋白免疫印跡技術(shù)能較好的實現(xiàn)該目的。蛋白免疲印跡技術(shù)是一種先擇性地結(jié)合被分離混合物中特異蛋白的分析技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、分辨率高、分析容量大，可對蛋白進(jìn)行定性、定量分析，檢測蛋白的時空表達(dá)變化情況，被廣泛應(yīng)用于蛋白定性實驗技術(shù)中。為在大學(xué)生創(chuàng)新實驗中推廣該技術(shù)，本教學(xué)實驗以貴州大學(xué)本科生為對象，課程的主要內(nèi)容包括了解蛋白印跡法的原理、目標(biāo)蛋白載體的構(gòu)建、蛋白可溶性表達(dá)、PAGE膠制作，以及蛋白質(zhì)免疫印跡試驗。該教學(xué)可提高學(xué)生對蛋白免疫印跡技術(shù)原理和實驗操作技能的認(rèn)識和掌握，同時訓(xùn)練學(xué)生在科研中的能力。

關(guān)鍵詞 蛋白 免疫印跡 實驗教學(xué)

中圖分類號：G642 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ?DOI：10.16400/j.cnki.kjdks.2021.01.022

Abstract In the process of biological function research， it is usually necessary to distinguish and detect the target protein from the mixed protein， and Western blot technology can better achieve this purpose. Protein immunoblotting is a kind of analytical technology that selectively combines the specific proteins in the separated mixture. It has high sensitivity， specificity， high resolution and large analysis capacity. It can be used for qualitative and quantitative analysis of proteins and detect the changes of spatiotemporal expression of proteins. It is widely used in the qualitative experiment of proteins. In order to popularize the technology in the innovative experiment of college students， this teaching experiment is aimed at undergraduates of Guizhou University. The main contents of the course include understanding the principle of western blotting， the construction of target protein vector， the soluble expression of protein， the preparation of page gel， and the protein immunoblot test. This teaching can improve students' understanding and mastery of Western blotting technology principle and experimental operation skills， and train students' ability in scientific research.

Keywords protein; immunoblotting; experimental teaching

蛋白質(zhì)印跡法（蛋白免疫印跡）即Western Blot，[1-2]是在DNA印跡法（Southern blot）和RNA印跡法（Northern blot）之后，整合電泳、轉(zhuǎn)印和免疫標(biāo)記為一體的蛋白分離檢測技術(shù)，是對電泳技術(shù)的進(jìn)一步延深和發(fā)展。目前是一種應(yīng)用比較廣泛的蛋白質(zhì)檢測實驗方法，主要應(yīng)用于免疫遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)中，同時也廣泛應(yīng)用于蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個領(lǐng)域。[3]其基本原理主要是將經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后的細(xì)胞或組織蛋白，用電印免疫印跡法轉(zhuǎn)移到固相支持物（化學(xué)惰性的高分子轉(zhuǎn)移膜，如聚偏二氟乙烯膜）上，然后將目標(biāo)蛋白的特異性抗體（一抗）與轉(zhuǎn)移膜上的目標(biāo)蛋白進(jìn)行免疫結(jié)合反應(yīng)，再用被辣根過氧化物酶標(biāo)記過的二抗與一抗結(jié)合，隨后通過分析著色的位置和著色深度來檢測目標(biāo)蛋白。

進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫檢測通常需經(jīng)過蛋白裂解及變性、蛋白電泳分離、轉(zhuǎn)模、封閉、一抗孵育、二抗孵育和特異性檢測等環(huán)節(jié)，由于該試驗涉及的步驟較多，對實驗設(shè)備及操作人員的要求較高，目前還未針對本科生開設(shè)此類課程。本文以貴州大學(xué)面向本科生開設(shè)的大學(xué)生開放性實驗課為基礎(chǔ)，對該實驗在本科實驗教學(xué)中進(jìn)行應(yīng)用，教學(xué)效果良好。

1 課程內(nèi)容設(shè)計

該課程為大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃課程，是農(nóng)業(yè)及生命科學(xué)學(xué)科的選修課程。整個實驗課程內(nèi)容為一個小設(shè)計型實驗項目。本課程的主要內(nèi)容包括掌握蛋白質(zhì)印跡法的原理、目標(biāo)蛋白載體的構(gòu)建、蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)、PAGE膠制作，以及Western blot實驗。

本課程通過設(shè)定不同條件（如溫度、菌株及不同IPTG，異丙基硫代半乳糖苷，Isopropyl-D-Thiogalactoside，濃度），以實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白的可溶性表達(dá)。由于本課程需進(jìn)行連續(xù)性實驗，課程均安排于周末進(jìn)行，共分為5次實驗及1次匯報，每次實驗時間約2～8學(xué)時，共約20～28學(xué)時。具體課程內(nèi)容和安排見表1。

2 代表性結(jié)果

以在實驗教學(xué)過程中1組同學(xué)選擇的高粱（Sorghum bicolor）的抗病蛋白STG1為例。同學(xué)們對STG1進(jìn)行了基因擴(kuò)增、生物信息學(xué)分析、載體pET28a載體構(gòu)建、原核表達(dá)條件摸索以及Western blot檢測，最終用Anti His抗體在重組菌株的上清樣品中檢測到一條清晰單一條帶，而空載體對照都沒有相應(yīng)條帶，說明STG1蛋白成功表達(dá)。

3 教學(xué)效果

3.1 增強(qiáng)學(xué)生對蛋白免疫印跡技術(shù)及相關(guān)生化實驗技術(shù)的理解

在本次大學(xué)生創(chuàng)新實驗教學(xué)中，首先讓學(xué)生利用在線網(wǎng)站和文獻(xiàn)檢索了解相關(guān)實驗技術(shù)，了解其原理和實驗操作步驟。其次，學(xué)生要通過自主設(shè)計實驗并驗證蛋白是否成功表達(dá)，前提就要求學(xué)生要對基因、蛋白有一定的了解。學(xué)生通過親自參與整個實驗設(shè)計與操作，更進(jìn)一步地增強(qiáng)了對蛋白免疫印跡技術(shù)及相關(guān)生化實驗技術(shù)的理解和掌握。

3.2 鍛煉學(xué)生的動手和分析能力

在實驗操作中，蛋白免疫印跡技術(shù)有兩大關(guān)鍵因素：（1）必須將分離的蛋白很好地從PAGE凝膠上轉(zhuǎn)到固相支持物上。在此過程中，對轉(zhuǎn)膜緩沖液的選擇顯得尤為重要，它對蛋白與膜和探針的結(jié)合起著決定性作用。（2）對抗體的選擇，抗體是目前在該技術(shù)中最常用的標(biāo)記探針。在實驗驗證環(huán)節(jié)，許多學(xué)生會出現(xiàn)沒有得到理想的預(yù)期結(jié)果（信號弱或無信號、條帶大小與預(yù)期不符、非特異條帶、背景高、污點等常見問題），這是可能由于在轉(zhuǎn)膜過程中所配緩沖液組分不對，抗體選擇不對（一抗、二抗選擇及濃度選擇），在轉(zhuǎn)膜時溫度過高，制作PAGE凝膠時膠上有氣泡、膠厚度不一致、凝固程度不一致等因素造成的。這些都需要學(xué)生在操作過程中認(rèn)真思考、按要求操作、多次摸索、總結(jié)經(jīng)驗、找出失敗原因，多與老師和同學(xué)進(jìn)行討論問題才能最終找到解決方案。問題能得到有效的解決，是鼓勵學(xué)生進(jìn)行下一步實驗的關(guān)鍵。對于在本實驗中出現(xiàn)的問題，說明學(xué)生的動手操作能力還不夠，在本科階段很有必要設(shè)立此類動手能力強(qiáng)的生化實驗類創(chuàng)新課程，提高本科生的實際動手操作能力。

3.3 實驗教學(xué)的推廣性分析

蛋白免疫印跡技術(shù)在分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中是一種非常實用的實驗技術(shù)。對于只了解其理論知識而未受到過實際操作培訓(xùn)的同學(xué)，具有實際的意義。對于農(nóng)業(yè)及生命科學(xué)學(xué)科類專業(yè)的同學(xué)，學(xué)校具備實施此類實驗技術(shù)的相關(guān)設(shè)備，更應(yīng)開設(shè)其相關(guān)實驗課程。此外，該實驗的最大優(yōu)勢就在于其適應(yīng)性好，不需要特殊的實驗儀器。因此，希望通過蛋白免疫印跡技術(shù)的推廣，能讓廣大本科生受益。

4 教學(xué)總結(jié)

對2019年度的教學(xué)總結(jié)發(fā)現(xiàn)，40%的實驗組通過自主學(xué)習(xí)下完成實驗，約55%的實驗組能在老師的指導(dǎo)下完成實驗，5%的實驗組不能順利完成實驗。教學(xué)實踐結(jié)果顯示該實驗適合于高年級本科生（大三、大四），最好有分子生物學(xué)以及基本的生物信息學(xué)基礎(chǔ)的同學(xué)。學(xué)生在課程結(jié)束時要PPT匯報，并寫一份實驗報告以及個人學(xué)習(xí)總結(jié)，以鍛煉他們的書面和口頭表達(dá)能力。從匯報和實驗報告來看，學(xué)生對實驗背景、材料與方法、實驗操作過程和各階段的實驗結(jié)果都有清晰的認(rèn)識。因此，非常有必要在本科教學(xué)中推廣此類課程。

*通訊作者：謝鑫

參考文獻(xiàn)

[1] Xu J， Bai L， Gu YY， Du F， Liu YJ. Synthesis， characterization， apoptosis， ROS， autophagy and western blotting studies of cyclometalated iridium（iii） complexes[J]. Inorganic Chemistry Communications，2019，111：107594.

[2] Moritz CP. 40 years Western blotting： A scientific birthday toast[J]. Journal of Proteomics， 2020，212.

[3] 宋亮，陳丹丹.淺談蛋白質(zhì)印跡法操作過程中的實驗技巧[J].科技資訊，2015，13（21）：63-65.