于棟，祝可心，安家慧，葉洋，李玉峰

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

豬傳染性胸膜肺炎是豬的一種呼吸系統(tǒng)急性接觸性傳染病，臨床癥狀包括高燒、咳嗽和流鼻涕[1]。該病各年齡階段的豬群均易感，發(fā)病率在10%以上，最急性型死亡率可達(dá)80%～100%，從急性和慢性感染中康復(fù)的豬可以持續(xù)排出病原體而沒(méi)有臨床癥狀，因此難以控制和根除[2-4]。自1957年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，豬傳染性胸膜肺炎對(duì)各國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)屬于巴氏桿菌科、放線桿菌屬，是一種革蘭陰性短桿狀細(xì)菌，是豬傳染性豬胸膜肺炎的重要致病因子[1]。APP共有15種血清型，不同血清型間交叉保護(hù)性低[5-6]。APP能夠產(chǎn)生多種毒力因子，包括溶血外毒素(Actinobacilluspleuropneumoniae-RTX-toxins，Apx)、外膜蛋白、脂多糖、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白、莢膜、菌毛等[7]，其中 Apx被認(rèn)為是APP最重要的毒力因子。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Apx有ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ[8]，其中ApxⅠ有較強(qiáng)的溶血活性；ApxⅡ溶血活性較弱[9]；ApxⅢ有強(qiáng)細(xì)胞毒性，不具有溶血活性[10]；ApxⅣ由所有APP血清型在感染豬體中產(chǎn)生，但在體外培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生[2]，由大腸桿菌表達(dá)的產(chǎn)物有較弱溶血活性[11]。與此同時(shí)，Apx也是APP主要的免疫原，在針對(duì)APP的各種疫苗中，使用ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅢ的重組蛋白作為疫苗抗原制備的亞單位疫苗在保護(hù)性方面顯示出良好的功效：馬艷芳[12]研究提取ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ毒素，發(fā)現(xiàn)其在豬傳染性胸膜肺炎的免疫保護(hù)過(guò)程中具有一定作用；周家強(qiáng)[9]將ApxⅡ A蛋白純化后免疫小鼠，三免后發(fā)現(xiàn)其抗體效價(jià)明顯提升，并且通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)證明ApxⅡ A蛋白在一定程度內(nèi)能夠增強(qiáng)滅活苗的免疫效果；王方昆等[13]研究發(fā)現(xiàn)ApxⅣ N端有良好的免疫原性；萬(wàn)玉萌等[14]表達(dá)了ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和外膜蛋白Omp2，并證明重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。APP血清學(xué)診斷方法的建立也常以Apx為抗原：Myunghwan等[2]開(kāi)發(fā)的ELISA方法可以評(píng)估動(dòng)物體內(nèi)針對(duì)ApxⅠ，ApxⅡ和ApxⅢ每種毒素的特異性抗體水平；李鳳梅等[5]研究發(fā)現(xiàn)以ApxⅣ-ELISA檢測(cè)APP具有一定的可行性，且具有特異性良好、準(zhǔn)確性較高、重復(fù)性較好的特點(diǎn)。

目前，國(guó)內(nèi)相關(guān)研究中制備的Apx毒素蛋白大多以包涵體形式存在，免疫原性較差。本研究選擇APP的ApxⅠ、ApxⅢ、ApxⅣ親水區(qū)進(jìn)行截短表達(dá)，以期提高重組蛋白在上清的表達(dá)量，為后續(xù)亞單位疫苗的制備以及建立具有較好特異性的ELISA檢測(cè)方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α、Rosetta(DE3)，APP血清2型和5型等由本實(shí)驗(yàn)室保存；原核表達(dá)載體pColdI、pET-32a購(gòu)自TaKaRa(大連)生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑

T4 DNA連接酶，購(gòu)于TaKaRa(大連)公司；DNA凝膠回收盒、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、瓊脂糖、小鼠抗6×His組氨酸單克隆抗體(mAb)，購(gòu)于南京天為公司；DNA Marker DL5000、2× Phanta Mix，購(gòu)于諾唯贊公司；DNA Marker DL2000，購(gòu)于擎科生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購(gòu)于南京生興生物技術(shù)有限公司；蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ、HindⅢ和SacⅠ，購(gòu)于賽默飛世爾科技(中國(guó))公司；細(xì)菌組DNA提取盒，購(gòu)于天根公司；質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自Biomiga；其余試劑為進(jìn)口/國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 截矩基因片段tApxⅠ、tApxⅢ、tApxⅣ的擴(kuò)增

參照TIANamp Bacteria DNA Kit說(shuō)明書(shū)，取3 mL過(guò)夜轉(zhuǎn)接的新鮮APP 2型和5型菌液提取總DNA。根據(jù)GenBank中收錄的APP ApxⅠ、ApxⅢ、ApxⅣ基因序列設(shè)計(jì)引物，并在ApxⅠ、ApxⅢ、ApxⅣ 3對(duì)引物的上、下游分別對(duì)應(yīng)引入XhoⅠ和HindⅢ的2個(gè)酶切位點(diǎn)，在ApxⅢ引物的上、下游分別對(duì)應(yīng)引入SacⅠ和XhoⅠ的2個(gè)酶切位點(diǎn)。引物合成由英濰捷基公司完成(序列見(jiàn)表1)。

以APP菌液提取的總DNA為模板，用上述引物擴(kuò)增tApxⅠ、tApxⅢ、tApxⅣ基因。PCR反應(yīng)體系如下：2×Phanta Mix 12.5 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，DNA模板2.0 μL，補(bǔ)水至25 μL。PCR擴(kuò)增條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行35個(gè)反應(yīng)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖核酸凝膠電泳進(jìn)行初步鑒定，參照凝膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行片段回收，將含有酶切位點(diǎn)的目的基因片段和pColdI空表達(dá)載體同時(shí)進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切，上述2種產(chǎn)物分別經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠核酸電泳，根據(jù)目的片段大小分別回收產(chǎn)物后進(jìn)行連接，上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入克隆感受態(tài)DH5α細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)37 ℃ 搖床200 r/min培養(yǎng)1 h后涂布于LB固體培養(yǎng)基(pColdI為Ampr)37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。經(jīng)PCR鑒定，挑取疑似陽(yáng)性的單克隆菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基(內(nèi)含有Ampr)培養(yǎng)12～16 h后提取質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果為陽(yáng)性后，送至通用公司測(cè)序，將所得的序列提交到NCBI網(wǎng)站上GenBank進(jìn)行序列比對(duì)，確認(rèn)正確的重組質(zhì)粒命名為pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅢ、pColdI-tApxⅣ。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.5 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白可溶性分析

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB固體培養(yǎng)基(pColdI、pET-32a為Ampr)置37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。從LB固體培養(yǎng)基上挑取陽(yáng)轉(zhuǎn)單克隆菌落，接種至LB液體培養(yǎng)基(pColdI、pET-32a為Ampr)，常規(guī)培養(yǎng)至菌液OD600范圍為0.4～0.6，加入IPTG使終濃度達(dá)到1 mmol·L-1，pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅢ、pColdI-tApxⅣ以160 r/min 15 ℃的條件誘導(dǎo)24 h后收集1 mL菌液，pET-32a- tApxⅠ以160 r/min 30 ℃的條件誘導(dǎo)8 h后收集1 mL菌液，同時(shí)收集誘導(dǎo)的pColdI、pET-32a空載體菌液做陰性對(duì)照。收集的菌液經(jīng)pH=7.4的PBS緩沖液洗滌2次后，以80 μL PBS緩沖液重懸并加入20 μL 5×SDS Loading buffer振蕩混勻瞬時(shí)離心煮沸5～10 min處理，經(jīng)SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)染色分析。獲得誘導(dǎo)后的重組蛋白，收集誘導(dǎo)表達(dá)的全菌以pH=7.4的PBS緩沖液洗滌2次并重懸，超聲波破碎裂解細(xì)胞，分別對(duì)上清和沉淀進(jìn)行收集及處理，經(jīng)12.5%凝膠SDS-PAGE檢測(cè)，判斷表達(dá)產(chǎn)物存在形式。

1.6 重組蛋白的Western blot鑒定及反應(yīng)原性分析

將重組蛋白rtApxⅠ、rtApxⅢ、rtApxⅣ的表達(dá)產(chǎn)物處理后的上清經(jīng)SDS-PAGE分離，將電泳后產(chǎn)物通過(guò)半干法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，將6×His單抗/豬多抗作為一抗，HRP-羊抗鼠/抗豬IgG作為二抗，進(jìn)行Western blot試驗(yàn)。

1.7 重組蛋白的純化

將100 mL經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液用PBS緩沖液洗滌2次后以結(jié)合緩沖液重懸進(jìn)行超聲裂解，13 000 r/min離心10 min后取上清用0.22 μm濾器過(guò)濾后作為蛋白樣品。參照Ni-NTA說(shuō)明書(shū)，先將10倍柱體積結(jié)合緩沖液通過(guò)鎳柱，然后加入蛋白樣品，之后用洗滌緩沖液洗滌樹(shù)脂，至流穿液中溶質(zhì)含量保持穩(wěn)定，最后以5倍柱體積洗脫緩沖液洗脫樹(shù)脂，收集純化樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的PCR及雙酶切鑒定

挑取抗性平板上的單克隆菌落培養(yǎng)提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及核酸凝膠電泳分別出現(xiàn)大小為1 713、1 350、1 467 bp左右的條帶(圖1A)，與預(yù)期大小一致。重組質(zhì)粒pColdI-tApxⅢ經(jīng)SacⅠ和XhoⅠ雙酶切，得到1 350 bp的基因片段和4 400 bp左右的載體片段；pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅣ經(jīng)HindⅢ和XhoⅠ雙酶切分別獲得1 713、1 467 bp左右的基因片段及4 400 bp的載體片段(圖1B)。測(cè)序結(jié)果正確，表明已成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅢ、pColdI-tApxⅣ。

M1.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；M2.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL5000；1.tApxⅠ基因；2.tApxⅢ基因；3.tApxⅣ基因；4.pColdI-tApxⅠ雙酶切；5.pColdI-tApxⅢ雙酶切；6.pColdI-tApxⅣ雙酶切

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅢ、pColdI-tApxⅣ轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE分析，在63、50和54 kDa左右的位置出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期相符。確定3種重組蛋白表達(dá)以后，將誘導(dǎo)后的細(xì)菌全菌經(jīng)過(guò)洗滌，超聲波破碎裂解離心，對(duì)經(jīng)過(guò)離心的上清液進(jìn)行凝膠SDS-PAGE分析。pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅢ、pColdI-tApxⅣ在上清均表達(dá)(圖2A、2B)。

M.預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.Rosetta/pColdI-tApxⅠ誘導(dǎo)后全菌；2.Rosetta/pColdI-tApxⅠ超聲破碎后上清；3.Rosetta/pColdI-tApxⅠ超聲破碎后沉淀；4.Rosetta/pColdI-tApxⅢ誘導(dǎo)后全菌；5.Rosetta/pColdI-tApxⅢ超聲破碎后上清；6.Rosetta/pColdI-tApxⅢ超聲破碎后沉淀；7.Rosetta/pColdI-tApxⅣ誘導(dǎo)后全菌；8.Rosetta/pColdI-tApxⅣ超聲破碎后上清；9.Rosetta/pColdI-tApxⅣ超聲破碎后沉淀

2.3 重組蛋白的Western blot鑒定

對(duì)含有重組表達(dá)質(zhì)粒pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅢ、pColdI-tApxⅣ的重組大腸桿菌Rosetta誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行可溶性分析，發(fā)現(xiàn)目的蛋白在上清與包涵體中均存在。誘導(dǎo)后的上清液加入上樣緩沖液煮沸處理，經(jīng)SDS-PAGE分析，以鼠抗His-IgG為一抗，HRP-羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blot分析，在63、50和54 kDa相應(yīng)位置出現(xiàn)特異性抗原抗體結(jié)合帶(圖3A)。同時(shí)，以陽(yáng)性豬血清作為一抗進(jìn)行孵育，然后以酶標(biāo)豬二抗進(jìn)行孵育后染色，結(jié)果證明表達(dá)的可溶性重組蛋白rtApxⅠ、rtApxⅢ、rtApxⅣ均與APP天然抗體發(fā)生特異性反應(yīng)(圖3B、3C)。

M.預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.超聲破碎后Rosetta/pColdI-tApxⅠ上清；2.超聲破碎后Rosetta/pColdI-tApxⅢ上清；3.超聲破碎后Rosetta/pColdI-tApxⅣ上清；4.超聲破碎后Rosetta/pColdI-tApxⅠ上清；5.超聲破碎后Rosetta/pColdI-tApxⅢ上清；6.超聲破碎后Rosetta/pColdI-tApxⅣ上清

2.4 重組表達(dá)蛋白的純化

SDS-PAGE結(jié)果表明，使用Ni-NTA親和層析純化，在0 mmol/L結(jié)合緩沖液、60 mmol/L 洗滌緩沖液的條件下能夠有效純化ApxⅠ(圖4A)；在30 mmol/L 結(jié)合緩沖液、100 mmol/L洗滌緩沖液的條件下能夠有效純化ApxⅢ(圖4B)；在20 mmol/L 結(jié)合緩沖液、60 mmol/L洗滌緩沖液的條件下能夠有效純化Ⅳ(圖4C)。

A.重組蛋白rtApxⅠ純化的SDS-PAGE分析：M.預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.超聲破碎后上清；2～3.流穿液；4～5.洗滌緩沖液；6～8.純化后蛋白

3 討論

由于包涵體需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的變性溶解和復(fù)性折疊過(guò)程，導(dǎo)致目的蛋白復(fù)性率低、損失量大，而可溶性蛋白表達(dá)則可以很好地避免這一問(wèn)題。為了實(shí)現(xiàn)目的蛋白的可溶性表達(dá)，本試驗(yàn)中對(duì)ApxⅠ、ApxⅢ、ApxⅣ的表達(dá)曾嘗試使用pColdI載體、pET-32a載體，更換宿主菌Rosetta，使用4種帶有伴侶蛋白的BL21質(zhì)粒(PG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2)，并且對(duì)誘導(dǎo)溫度、轉(zhuǎn)速、時(shí)長(zhǎng)、IPTG濃度以及誘導(dǎo)前的菌液濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，最終實(shí)現(xiàn)了pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅢ、pColdI-tApxⅣ的可溶性表達(dá)。pET-32a載體雖然帶有融合蛋白有利于實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，但重組蛋白用于后續(xù)試驗(yàn)時(shí)需去除載體的融合蛋白，且用pET-32a載體的表達(dá)效果不如pColdI載體，故選擇pColdI載體進(jìn)行蛋白的可溶性表達(dá)。重組蛋白帶有His標(biāo)簽，可使用Ni-NTA進(jìn)行純化，通過(guò)優(yōu)化結(jié)合液、洗滌液、洗脫液中的咪唑濃度，從而獲得了純化效果較好的rtApxⅠ、rtApxⅢ、rtApxⅣ重組蛋白。

目前，我國(guó)主要通過(guò)接種全菌滅活疫苗來(lái)預(yù)防豬傳染性胸膜肺炎，但由于APP血清型較多，不同血清型之間交叉保護(hù)性低，常規(guī)疫苗的使用已經(jīng)無(wú)法達(dá)到有效預(yù)防該疾病的目的。Park等[15]研究曾表明使用重組Apx毒素的抗APP亞單位疫苗對(duì)不同血清型具有良好的交叉保護(hù)作用，因此當(dāng)前許多可用的疫苗都將多個(gè)血清型共有的Apx作為其關(guān)鍵抗原[16]。劉建杰等[17]利用大腸桿菌表達(dá)APP的分泌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ，提取表達(dá)產(chǎn)物包涵體，再加入APP 7型菌制成亞單位菌苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用APP 1型和APP 7型菌株進(jìn)行攻毒后其保護(hù)力分別為83.3%和91.7%。邵美麗等[18]用重組蛋白ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ、Omp組合作為免疫原免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種4組重組蛋白小鼠的特異性抗體水平較高，且該組用APP 1型菌和APP 2型菌進(jìn)行攻毒后的保護(hù)率也優(yōu)于其他組。Park等[15]研究中開(kāi)發(fā)的由ApxⅠA和ApxⅡA片段組成的二價(jià)疫苗顯示出針對(duì)APP血清1型、2型菌株的交叉保護(hù)作用。本研究在實(shí)驗(yàn)室可溶性表達(dá)蛋白的基礎(chǔ)上，成功對(duì)tApxⅠ、tApxⅢ進(jìn)行了可溶性表達(dá)，期望這2種重組蛋白可以共同作為有效抗原成分，從而制備出具有較好免疫保護(hù)效果的亞單位疫苗。

ELISA檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、快速，且具有良好的敏感性，是常用的血清學(xué)診斷方法。ApxⅣ只在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)且僅由APP產(chǎn)生，根據(jù)這一特點(diǎn)建立的ApxⅣ-ELISA可有效區(qū)分APP滅活疫苗或亞單位疫苗免疫豬與自然感染豬[19]，并能與其他的豬呼吸道疾病病原如豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌等進(jìn)行鑒別診斷[13,19]。González 等[20]利用ELISA方法檢測(cè)了在試驗(yàn)條件下接種APP的豬的血清和口腔液中的ApxⅣ特異性抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種APP血清1型和7型的豬的ApxⅣ血清和口腔液的抗體反應(yīng)與LPS抗體反應(yīng)模式相近。市場(chǎng)上在售的APP-ELISA檢測(cè)試劑盒中，國(guó)外的試劑盒價(jià)格昂貴，國(guó)內(nèi)的試劑盒采用的是間接ELISA檢測(cè)方法，特異性較差。本研究將ApxⅣ表達(dá)在上清，后期可以制備ApxⅣ特異性單克隆抗體并將其應(yīng)用于高效、靈敏地阻斷ELISA方法的建立，以期研制出成本低廉且具有較好特異性的ApxⅣ-ELISA診斷試劑盒。

綜上所述，本研究在實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)ApxⅡ和Omp2蛋白研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)條件優(yōu)化使tApxⅠ、tApxⅢ、rtApxⅣ重組蛋白表達(dá)在上清并成功純化，為研制具有較好交叉保護(hù)性的亞單位疫苗以及建立有效區(qū)分APP滅活疫苗或亞單位疫苗免疫豬與自然感染豬的ELISA檢測(cè)方法奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。