張宏竹,汪艷,常廣軍,沈向真

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

奶牛肝臟炎癥是一種臨床上常見的疾病，通常是由于瘤胃中的pH降低引起革蘭陰性菌裂解，繼而釋放大量脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，透過瘤胃壁經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入肝臟所導(dǎo)致[1-3]。LPS進(jìn)入肝臟后，會(huì)被細(xì)胞表面的Toll樣受體4(TLR4)識(shí)別，繼而引起核因子κB (NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等一系列下游信號(hào)通路的激活，激活的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與炎癥相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)等炎性相關(guān)基因的表達(dá)[4]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證明，LPS能夠引起奶牛肝臟原代細(xì)胞(BHEC)炎癥以及脂肪酸代謝紊亂[5]，對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡同樣具有促進(jìn)作用[6-7]。瘤胃來源的LPS也被證明和多種奶牛疾病有關(guān)，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[8]。

?；撬?taurine，TAU)是一種動(dòng)物機(jī)體內(nèi)普遍存在的游離氨基酸，在許多生物進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[9]。研究表明?；撬釋?duì)于減輕細(xì)胞損傷效果顯著，赭曲霉素A引起的豬腎細(xì)胞凋亡和自噬在添加?；撬岜Ｗo(hù)后被顯著抑制[10]；同時(shí)?；撬崮軌蚓徑釲PS引起的小鼠乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[11]。但是?；撬崾欠窨梢杂糜诒Ｗo(hù)LPS引起的BHEC炎癥反應(yīng)目前尚不清楚。本文旨在探究?；撬犷A(yù)處理對(duì)LPS引起的BHEC炎癥反應(yīng)的保護(hù)及相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控作用，為臨床上治療奶牛肝臟炎癥提供一種可行的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LPS、?；撬?，購(gòu)自Sigma公司；RNA iso Plus，購(gòu)自TaKaRa公司；DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司；熒光定量、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自南京市諾唯贊Vazyme生物科技股份公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，購(gòu)自Thermo fisher公司；細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)(CCK-8)試劑盒、蛋白提取試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶生物科技公司；聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠快速制備試劑盒、三色預(yù)染蛋白Marker、ECL發(fā)光液，購(gòu)自上海雅酶生物科技公司；蛋白上樣緩沖液，購(gòu)自Biosharp公司；核因子κB 亞基P65(P65)兔單克隆抗體、磷酸化核因子κB 亞基P65(p-P65)兔多克隆抗體、核因子κB 抑制蛋白(p-IκB)兔單克隆抗體、磷酸化核因子κB 抑制蛋白(IκB)兔單克隆抗體、TLR4兔多克隆抗體，購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。

LPS溶液配制：稱取10 mg LPS粉末加入5 mL超純水稀釋配置成濃度為2 mg/mL的LPS溶液，用孔徑0.22 μm的無菌濾器過濾，放置于-20 ℃保存；牛磺酸溶液配置：稱取5 g?；撬岱勰┘尤?00 mL PBS緩沖液，溶解后用0.22 μm無菌濾器過濾配置成濃度為200 mmol/L的?；撬崛芤?。

1.2 BHEC的分離與培養(yǎng)

采用活體穿刺法從泌乳中期荷斯坦奶牛(產(chǎn)后160 d左右)體內(nèi)采集1～3 g肝組織，浸泡在70%乙醇中短暫消毒后，放入裝有5 mL 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和0.05 mol/L 2-氨基乙基醚(EGTA)的10 mL無菌試管中運(yùn)輸保存。待返回試驗(yàn)室，用手術(shù)刀將肝組織切成小塊，加入適量不含Ca2+和Mg2+的Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)溶液，1 000 r/min離心3 min，再用50 mL含1 mmol/L CaCl2和150 U/mL Ⅰ 型膠原酶的HBSS重懸。放入無菌培養(yǎng)箱中緩慢搖動(dòng)，37 ℃孵育40 min。待孵育結(jié)束，加入25 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中和膠原酶。用200目細(xì)胞過濾器過濾細(xì)胞懸液，PBS洗滌3次，用完全培養(yǎng)基(含有10% FBS、1 nmol/L胰高血糖素、10 nmol/L地塞米松、10 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子、10 nmol/L胰島素、90% 基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及1%青鏈霉素)重懸，以每瓶3×105密度接種在T75培養(yǎng)瓶中。放入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本試驗(yàn)中使用的細(xì)胞均為第6～8代。

1.3 試驗(yàn)分組

12孔板中每孔接種3×105個(gè)細(xì)胞，待到細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，添加不同試劑進(jìn)行處理，試驗(yàn)分為4組，即PBS處理6 h的對(duì)照組(CON)、牛磺酸處理6 h組(TAU)、LPS處理6 h組(LPS)、?；撬犷A(yù)處理6 h后更換為L(zhǎng)PS處理液處理6 h組(LT)。

1.4 細(xì)胞活力測(cè)定

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞，使用?；撬峄騆PS分別處理6 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育4 h，酶標(biāo)儀450 nm測(cè)吸光度。細(xì)胞活力的計(jì)算公式為：細(xì)胞活力=(OD處理組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%。其中處理組，添加細(xì)胞、CCK-8溶液以及LPS處理液；對(duì)照組，添加細(xì)胞和CCK-8處理液；空白組，添加CCK-8溶液和LPS處理液。

1.5 RNA提取和熒光定量PCR反應(yīng)

12孔板每孔加入1 mL RNA iso Plus，根據(jù)說明書提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定濃度并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Green相對(duì)熒光定量PCR方法，使用ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)，反應(yīng)體系為20 μL，包含SYBR 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL、cDNA 2 μL、超純水7.2 μL。采用兩步擴(kuò)增法，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)，以GAPDH為內(nèi)參。所得數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCt法。RT-qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物列表如表1。

1.6 Western blot檢測(cè)

細(xì)胞總蛋白使用蛋白提取試劑盒提取，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，各樣品稀釋成統(tǒng)一濃度。使用10% SDS-PAGE分離蛋白后，將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(孔徑：0.22 μm)上，轉(zhuǎn)印完成后，磷酸化蛋白使用5% BSA封閉2 h，其余蛋白采用5%脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃孵育12 h，二抗室溫孵育1 h，用ECL發(fā)光液顯影。

1.7 免疫熒光

細(xì)胞接種于爬片上，處理完成后用PBS清洗，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%～0.25% Triton X-100孵育15 min，封閉30 min后，一抗4 ℃孵育過夜，PBS清洗后二抗37 ℃孵育1 h，PBS清洗后DAPI染色5 min，用抗熒光淬滅劑將爬片倒扣在載玻片上，共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

分別采用Graphpad prism 8.0和IBM SPSS Statistics 21進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析，單因素方差分析(One-way ANOVA)，Dunnett法比較組間均值，所有結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞活力測(cè)定

分別用不同濃度的LPS和牛磺酸處理細(xì)胞6 h，結(jié)果如圖1所示，當(dāng)LPS和?；撬岬臐舛确謩e大于12 μg/mL和20 mmol/L時(shí)，細(xì)胞活力出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)，所以分別選取濃度為2、4、8、10、12 μg/mL的LPS和5、10、15、20 mmol/L的?；撬徇M(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

與對(duì)照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 LPS和牛磺酸最佳處理濃度的確定

如圖2所示，不同濃度梯度的LPS處理細(xì)胞后，IL-8的mRNA表達(dá)量均極顯著上升(P<0.01)，而P65的表達(dá)量在LPS濃度為2 μg/mL時(shí)顯著上升(P<0.05)，其余濃度無顯著性變化(P>0.05)。不同濃度的?；撬犷A(yù)處理細(xì)胞后，使用濃度為2 μg/mL的LPS處理，基因表達(dá)結(jié)果如圖3所示，與LPS處理組相比，濃度為10 mmol/L的?；撬犷A(yù)處理細(xì)胞后，IL-8的基因表達(dá)無顯著下調(diào)(P>0.05)，P65的基因表達(dá)極顯著下調(diào)(P<0.01)，其余各濃度牛磺酸均能使IL-8和P65的表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。因此采用濃度為2 μg/mL的LPS和20 mmol/L的牛磺酸進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 ?；撬犷A(yù)處理對(duì)LPS引起的BHEC炎癥相關(guān)基因表達(dá)變化的影響

熒光定量PCR結(jié)果如圖4A所示，與對(duì)照組相比，LPS組的炎性因子IL-6和趨化因子IL-1β、IL-8的基因表達(dá)極顯著升高(P<0.01)；對(duì)照組和TAU組之間IL-6、IL-8的表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)；與LPS組相比，LT組的IL-6、IL-8表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，IL-1β表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

圖2 不同濃度LPS引起的BHEC炎癥基因變化

與LPS組相比，#表示差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.4 ?；撬犷A(yù)處理對(duì)LPS引起的BHEC內(nèi)NF-κB通路相關(guān)基因mRNA水平的影響

如圖4B所示，LPS組中的P65 mRNA表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，TLR4 mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而添加?；撬岜Ｗo(hù)后，與LPS組相比，LT組中的P65 mRNA表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)，TLR4 mRNA表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；各組中IκB mRNA表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。

2.5 ?；撬犷A(yù)處理對(duì)LPS引起的BHEC內(nèi)TLR4-NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

通過Western blot測(cè)定細(xì)胞總蛋白中p-P65、P65、p-IκB、IκB、TLR4的表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示。與對(duì)照組相比，LPS組中的p-P65/P65、p-IκB/IκB表達(dá)量極顯著升高(P<0.01),TLR4表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，TAU組中的p-P65/P65、p-IκB/IκB、TLR4表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。在添加了牛磺酸保護(hù)后，相比于LPS組，LT組中的p-P65/P65表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，p-IκB/IκB表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)，TLR4表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。

圖4 牛磺酸預(yù)處理對(duì)LPS引起的BHEC炎癥基因(A)和TLR4-NF-κB通路相關(guān)基因(B)mRNA水平的影響

2.6 免疫熒光檢測(cè)P65蛋白在細(xì)胞中的定位

免疫熒光結(jié)果如圖6所示，與對(duì)照組相比，LPS刺激后，細(xì)胞核內(nèi)的P65含量明顯升高，而添加了?；撬岜Ｗo(hù)后，與LPS組相比，細(xì)胞核內(nèi)P65的含量明顯下降，說明了?；撬犷A(yù)處理減少了LPS引起的P65的入核，抑制了NF-κB信號(hào)通路的激活。

圖5 牛磺酸預(yù)處理對(duì)LPS引起的BHEC內(nèi)TLR4-NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖6 ?；撬犷A(yù)處理對(duì)LPS引起的BHEC中P65入核情況的影響(標(biāo)尺=20 μm)

3 討論

亞急性瘤胃酸中毒(SARA)發(fā)生時(shí)，瘤胃內(nèi)pH下降，造成大量革蘭陰性菌裂解，釋放大量LPS，經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入肝臟、乳腺等器官，繼而導(dǎo)致肝臟炎癥、乳腺炎、蹄葉炎等疾病的發(fā)生[12]，給奶牛養(yǎng)殖行業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。大量試驗(yàn)表明，LPS可以引起奶牛肝臟細(xì)胞損傷以及代謝紊亂。經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟的LPS可以誘導(dǎo)奶牛肝臟組織炎癥及凋亡的發(fā)生[6,13]。本試驗(yàn)采用了Xu等[5]報(bào)道的方法分離BHEC，并分別添加牛磺酸和LPS處理，成功建立奶牛肝臟炎癥體外模型，對(duì)?；撬嵴{(diào)控LPS引起的BHEC炎癥進(jìn)行研究。

TLR4是細(xì)胞表面的一種模式識(shí)別受體(PRRs)，在天然免疫過程中發(fā)揮重要作用[14]。LPS被細(xì)胞表面的TLR4識(shí)別后，激活下游的NF-κB。通常情況下NF-κB的兩個(gè)亞基與IκB組成三聚體廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中，LPS刺激后，IκB被IκB激酶(IKK)磷酸化激活，從NF-κB-IκB三聚體中釋放，繼而進(jìn)入蛋白酶體中降解，失去了IκB的NF-κB處于磷酸化的激活狀態(tài)，轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核中，與相關(guān)細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控其表達(dá)[15-17]。LPS引起的炎癥通路蛋白的激活已在多種體外模型中得到驗(yàn)證[18-20]。本試驗(yàn)通過Western blot和免疫熒光等方法，發(fā)現(xiàn)LPS刺激后，BHEC內(nèi)TLR4、p-IκB和p-P65的蛋白水平顯著升高，核內(nèi)P65水平顯著上升，證明TLR4-NF-κB炎癥信號(hào)通路被激活。IL-1β、IL-6、IL-8是重要的炎性介質(zhì)，參與機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，其中，IL-8在炎癥早期產(chǎn)生，對(duì)炎癥的發(fā)生發(fā)展具有重要指征作用[21]。LPS可以通過激活NF-κB來提高BHEC中IL-1β、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子的表達(dá)[19]。此外，LPS還可以引起NF-κB的入核，繼而引起奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥及氧化應(yīng)激[22]。本試驗(yàn)對(duì)BHEC添加LPS刺激后，IL-1β、IL-6、IL-8等炎性因子的mRNA表達(dá)顯著升高，說明炎癥細(xì)胞模型構(gòu)建成功，炎癥相關(guān)信號(hào)通路被激活，與上述結(jié)果基本一致。

?；撬?，又名2-氨基乙磺酸，是機(jī)體內(nèi)富含的一種含硫β氨基酸，廣泛存在于動(dòng)物組織中[23]。有研究表明，?；撬嵩诳寡趸翱寡追矫嫘Ч@著[24-26]。由三氧化物引起的骨骼肌活性氧增多在補(bǔ)充?；撬岷蟮玫礁纳芠27]。?；撬釋?duì)炎癥的治療作用可以通過抑制NF-κB的激活來實(shí)現(xiàn)[28]。通過添加不同劑量的牛磺酸，可以顯著降低由LPS引起的小鼠乳腺上皮細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)[11]。同時(shí)，?；撬峥梢砸种朴纱竽c桿菌引起的奶牛乳腺上皮細(xì)胞TLR4-NF-κB信號(hào)通路激活，繼而抑制下游一系列細(xì)胞因子表達(dá)[29]。本研究通過對(duì)細(xì)胞預(yù)處理牛磺酸進(jìn)行保護(hù)，顯著降低了LPS引起的IL-1β、IL-6、IL-8、P65、TLR4 mRNA表達(dá)，抑制了p-P65、p-IκB、TLR4的蛋白表達(dá)以及核內(nèi)P65水平，證明牛磺酸通過抑制TLR4-NF-κB信號(hào)通路的激活，抑制了LPS引起的BHEC炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本試驗(yàn)成功構(gòu)建了?；撬岜Ｗo(hù)LPS引起的BHEC炎癥反應(yīng)體外模型，證明了?；撬釋?duì)LPS誘導(dǎo)BHEC炎癥的保護(hù)作用及其相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控作用，為臨床上通過在飼料中添加?；撬嶂委熌膛８闻K炎癥提供了一定的理論依據(jù)。