周志楠，陳 祥*，張 艷，楊沛方，惠茂茂，唐 文，洪 磊

(1.貴州大學(xué) 高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

繁殖性狀，特別是多羔性狀，是山羊重要的經(jīng)濟(jì)性狀。隨著人們生活水平的提高和對(duì)羊肉需求量的增加，提高地方山羊品種的繁殖力十分重要，但山羊的多羔遺傳效力低，每胎僅產(chǎn)1～2羔，在一定程度上限制了山羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，故研究與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的主效基因可提高山羊繁殖力，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。黔北麻羊是貴州省優(yōu)良地方品種之一，因其具有高產(chǎn)、早熟、耐粗飼等特點(diǎn)而被專家批準(zhǔn)為貴州省新遺傳資源，是研究山羊繁殖性能的理想模型[1-2]。組織蛋白酶(cathepsin,CTS)家族已被證實(shí)廣泛存在于各類細(xì)胞或組織中并參與表達(dá)[3]，能夠催化蛋白質(zhì)的水解并調(diào)節(jié)各種正常的生物學(xué)過(guò)程，例如細(xì)胞死亡、增殖、遷移、癌癥以及抗原抗體的加工等[4-5]。組織蛋白酶家族包含多種亞型，到目前為止，組織蛋白酶A至Z均有研究報(bào)道[6]。就組織蛋白酶的水解機(jī)制而言，組織蛋白酶主要包括半胱氨酸組織蛋白酶(組織蛋白酶B、C、S、Z等)、絲氨酸組織蛋白酶(組織蛋白酶A、G)和天冬氨酸組織蛋白酶(組織蛋白酶D、E)[7]。組織蛋白酶D(cathepsin D,CTSD)是溶酶體的主要成分之一，在細(xì)胞內(nèi)以兩條鏈形式存在，由二硫鍵連接的氨基末端輕鏈(14 ku)和羧基末端重鏈(34 ku) 組成[7]，主要參與蛋白質(zhì)的水解，也與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)與促進(jìn)、癌癥的發(fā)展、周期有關(guān)[8]。大量研究表明，CTSD是一種普遍表達(dá)的天冬氨酸溶酶體蛋白酶，在大多數(shù)組織和細(xì)胞中發(fā)揮作用。不僅有利于肌肉的自溶，而且在調(diào)節(jié)小鼠情緒穩(wěn)定中起重要作用[9]，還是豬經(jīng)濟(jì)性狀的候選基因[10]。此外，CTSDmRNA已在子宮[11]、肝[12]、卵巢[13]和骨[14]等多個(gè)組織中建立表達(dá)圖譜。且CTSD的表達(dá)會(huì)受到卵巢中孕激素的調(diào)控，在卵母細(xì)胞發(fā)育期間表達(dá)量顯著升高，是卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一；還有研究表明，CTSD的遺傳變異可能與卵巢的品質(zhì)性狀有關(guān)[15]，在妊娠早期綿羊的卵巢中也能夠檢測(cè)到此基因的表達(dá)[11]。雖然CTSD已在豬[16]、牛[17]、綿羊[18]等多種動(dòng)物中克隆及測(cè)序驗(yàn)證，但其對(duì)山羊顆粒細(xì)胞的影響機(jī)理及產(chǎn)羔性狀的調(diào)控機(jī)制未見(jiàn)研究報(bào)道。

本研究通過(guò)構(gòu)建pEGFP-N3-CTSD真核表達(dá)載體并導(dǎo)入黔北麻羊卵泡顆粒細(xì)胞以驗(yàn)證其對(duì)顆粒細(xì)胞增殖、凋亡、周期及相關(guān)因子表達(dá)的影響機(jī)制，同時(shí)判斷顆粒細(xì)胞中上調(diào)CTSD對(duì)多胎性狀候選基因在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平的表達(dá)變化，以期為進(jìn)一步探明CTSD對(duì)山羊產(chǎn)羔性狀的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黔北麻羊來(lái)自遵義市習(xí)水縣富興牧業(yè)有限公司，根據(jù)繁殖記錄，分別選取飼糧組成、免疫程序、飼養(yǎng)環(huán)境等外部因素均相同的5只36周齡的多胎(產(chǎn)羔數(shù)量為3只)黔北麻羊母羊進(jìn)行放血屠宰，分兩批進(jìn)行，屠宰時(shí)嚴(yán)格按照貴州地方標(biāo)準(zhǔn)《羊屠宰操作規(guī)程》(DB22/T 2740—2017)進(jìn)行，將采集的卵巢組織分為兩個(gè)部分，用于組織總RNA提取的卵巢組織置于液氮(-196 ℃)中保存。其次，將用于卵泡顆粒細(xì)胞培養(yǎng)的卵巢組織置于預(yù)冷的含青鏈霉素的PBS磷酸鹽緩沖液(事前經(jīng)高溫高壓滅菌處理)中保存。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol?試劑、第一鏈cDNA合成試劑盒、熒光定量Mix、液氮、TAE緩沖液、異丙醇、無(wú)水乙醇、西班牙瓊脂糖、卡那霉素粉末、PBS緩沖液、LipofectamineTM3000 Reagent均購(gòu)自艾瑞特生物(貴州)；膠回收試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技(北京)；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)；限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I、Xho I與DNA Maker 2000、DNA Maker 5000均購(gòu)自寶生物工程(大連)；DNA連接試劑盒、LB肉湯均購(gòu)自生工生物工程(上海)；CCK-8細(xì)胞增殖試劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)(上海)；兔抗CTSD多克隆抗體(bs-1615R)、兔抗BMPR-IB抗體(bs-6639R)、兔抗FSHR抗體(bs-0895R)、兔抗INHA抗體(bs-1032R)均購(gòu)自Bioss(北京)；內(nèi)參抗體β肌動(dòng)蛋白(AF7018)購(gòu)自Affinity(美國(guó))；0.25%不含EDTA胰酶、DMEM/F-12、胎牛血清、青鏈霉素混合液均購(gòu)自Gibco(美國(guó))；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自凱基生物技術(shù)(江蘇)。pEGFP-N3載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡、超微量分光光度計(jì)、PCR擴(kuò)增儀(C1000 TouchTM)、流式細(xì)胞儀均購(gòu)自Thermo Scientific(美國(guó))。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 目的基因、功能基因引物的設(shè)計(jì)與合成 以GenBank庫(kù)中發(fā)布的山羊CTSD基因mRNA序列(登錄號(hào)：XM_018043344.1)為參考；利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其中，熒光定量引物用于RT-qPCR 試驗(yàn)，CDS區(qū)擴(kuò)增引物用于載體的構(gòu)建，在擴(kuò)增引物的上、下游處分別添加X(jué)ho I與EcoR I酶切位點(diǎn)。同時(shí)，以山羊BMPR-IB(登錄號(hào)：XM_013964509.2)、FSHR(登錄號(hào)：NM_001285636.1)、INHA(登錄號(hào)：NM_001285606.1)為功能基因參照，以山羊Bcl-2(登錄號(hào)：XM_01 8039337.1)、Bax(登錄號(hào)：XM_013971446.2)、Caspase-3(登錄號(hào)：XM_018041755.1)為細(xì)胞凋亡相關(guān)基因參照，以CyclinA1(登錄號(hào)：XM_018056659.1)、CyclinD2(登錄號(hào)：XM_005680985.3)、CyclinE(登錄號(hào)：XM_018062248.1)為細(xì)胞周期相關(guān)因子參照。分別設(shè)計(jì)9對(duì)用于RT-qPCR試驗(yàn)的引物，內(nèi)參基因β-actin參照周志楠等[19]所用序列。引物詳細(xì)信息見(jiàn)表1。設(shè)計(jì)完畢后將引物送至生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)股份有限公司合成。

表1 各引物詳細(xì)信息Table 1 Detailed information of each primer

1.3.2 組織總RNA的提取及cDNA的合成 使用液氮研磨結(jié)合TRIzol試劑提取黔北麻羊卵巢組織總RNA，提取完畢后，取1 μL RNA提取液置于超微量分光光度計(jì)中檢測(cè)其濃度及純度，根據(jù)濃度值、RNA圖譜及OD260 nm/OD280 nm比值判斷RNA的質(zhì)量。同時(shí)，以cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書將卵巢組織RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，體系為20 μL：RNA Template 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，DEPC-ddH2O 7 μL，2× Reaction mix 10 μL，StarScript II RT mix 1 μL。短暫混勻離心后，于PCR儀中42 ℃孵育50 min，85 ℃酶失活孵育5 min，合成的cDNA產(chǎn)物于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 pEGFP-N3-CTSD真核表達(dá)載體的構(gòu)建 以合成的卵巢cDNA第一鏈為模板，PCR擴(kuò)增CTSD基因的CDS區(qū)，擴(kuò)增后，在紫外光的照射下將含有目的條帶的膠條切下，根據(jù)康為(北京)試劑有限公司試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行回收。復(fù)蘇pEGFP-N3載體，用Xho I與EcoR I進(jìn)行雙酶切(37 ℃水浴3 h) 使其暴露與擴(kuò)增引物相同的粘性末端，并將產(chǎn)物與酶切后的pEGFP-N3載體進(jìn)行連接(16 ℃金屬浴12 h)，隨后，將連接產(chǎn)物加入復(fù)蘇后的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，并均勻涂布至含有卡那霉素抗性的LB平板上，過(guò)夜培養(yǎng)后，用槍頭挑取平板中的白色斑點(diǎn)至裝有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，搖晃擴(kuò)大培養(yǎng)16 h(37 ℃，200 r·min-1)。待菌液渾濁后，進(jìn)行菌液PCR反應(yīng)，篩選出陽(yáng)性菌液進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，將測(cè)序比對(duì)正確的陽(yáng)性菌液擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取，隨后使用EcoR I與Xho I對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，判斷pEGFP-N3-CTSD真核表達(dá)載體是否構(gòu)建成功。

1.3.4 黔北麻羊卵泡顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng) 黔北麻羊卵泡顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[20]，即在超凈工作臺(tái)中，使用75%酒精、蒸餾水與PBS緩沖液對(duì)卵巢組織進(jìn)行沖洗，10號(hào)針頭扎破卵巢表面的大卵泡，使卵泡液流入含有青鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，并用吸頭吸取DMEM/F-12培養(yǎng)基反復(fù)沖洗卵巢組織，使卵巢中的卵泡液盡可能被沖出以提高細(xì)胞數(shù)量，然后將含有卵泡液的DMEM/F-12移至10 mL滅菌離心管中，靜置10～20 min沉淀細(xì)胞，800 r·min-1離心10 min，棄除上層液體，再加入適量的DMEM/F-12培養(yǎng)基吹打混勻，制成懸液。隨后將其轉(zhuǎn)移至25 cm2透氣細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，向瓶中加入由10%胎牛血清、2%青鏈霉素、88%DMEM/F-12組成的完全培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后方可第一次換液，第一次換液后每隔48 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液。

1.3.5 pEGFP-N3-CTSD真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞 待細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞并鋪至6孔板內(nèi)，按Lipofecta mineTM3000 Reagent試劑盒說(shuō)明書分別將空載體pEGFP-N3、真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3-CTSD導(dǎo)入細(xì)胞，每孔設(shè)置3個(gè)重復(fù)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，在細(xì)胞倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白數(shù)量以初步判斷轉(zhuǎn)染效率。

1.3.6 細(xì)胞增殖檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，將6孔板取出，用PBS緩沖液清洗3次，每孔加入500 μL胰酶37 ℃消化3～5 min，待細(xì)胞消化80%～90%后加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻后鋪至96孔板，并設(shè)置不同細(xì)胞濃度梯度，以確定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)，隨后將96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至完全貼壁，每孔加入10 μL CCK-8試劑，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，以保證CCK-8試劑完全與細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，在酶標(biāo)儀中分別測(cè)定細(xì)胞在0、6、12、24、48、72 h的吸光值以判斷細(xì)胞增殖情況。

1.3.7 細(xì)胞周期檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析 本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)pEGFP-N3-CTSD真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)黔北麻羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡及周期的影響，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，棄去各孔中的舊培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗3遍，用0.25%不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞從孔壁脫落時(shí)，加入完全培養(yǎng)基終止消化并將其收集至離心管中，4 ℃ 2 000 r·min-1離心5 min，棄上清，再使用預(yù)冷的75%乙醇重懸細(xì)胞，4 ℃過(guò)夜固定，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，使用PBS緩沖液清洗細(xì)胞使其成為細(xì)胞懸液，1 000 r·min-1離心5 min，在避光條件下加入500 μL用PBS配置的PI染色液，4 ℃避光保存，1 h后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，檢測(cè)完畢后使用Excel軟件記錄細(xì)胞不同周期的數(shù)量，用T-TEST判斷顯著性,并使用Graphpad prism 6軟件進(jìn)行繪圖。

1.3.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析 與細(xì)胞周期檢測(cè)類似，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h時(shí)，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率并更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，使用凱基生物技術(shù)公司的Annexin V-EGFP/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，用0.25%不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后，轉(zhuǎn)至離心管中800 r·min-1離心5 min，棄上清，用預(yù)冷的PBS緩沖液反復(fù)清洗管底細(xì)胞，800 r·min-1離心5 min，棄上清，先后加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞、5 μL Annexin V-EGFP 與5 μL Propidium Iodide，混勻后室溫避光反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。數(shù)據(jù)分析與細(xì)胞周期類似。

1.3.9 細(xì)胞水平實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)分析 分別將pEGFP-N3-CTSD真核表達(dá)質(zhì)粒與pEGFP-N3空載體導(dǎo)入細(xì)胞24 h后，提取細(xì)胞中的總RNA并進(jìn)行定量，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，方法見(jiàn)“1.3.2”，逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，以cDNA第一鏈為模板結(jié)合相關(guān)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)預(yù)混液體系為20 μL：上、下游引物(10 μmoL·L-1)各0.6 μL，cDNA 模板1 μL，2× RealStar Green Fast Mixture 10 μL，ddH2O補(bǔ)充至20 μL。檢測(cè)pEGFP-N3-CTSD真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)目的基因CTSD，功能基因BMPR-IB、FSHR、INHA，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Caspase-3及細(xì)胞周期蛋白因子CyclinA1、CyclinD2、CyclinE在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化，反應(yīng)結(jié)束后，使用2-ΔΔCt對(duì)相關(guān)基因在細(xì)胞水平的實(shí)際表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算，用單因素方差分析及T-TEST計(jì)算差異是否達(dá)到顯著水平，分別以P<0.05、P<0.01作為差異顯著與極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.10 細(xì)胞總蛋白的提取 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，將6孔板取出，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗后，每孔加入200 μL 細(xì)胞RIPA裂解液(含2 μL PMSF，以防止蛋白快速降解)，置于冰上裂解35 min，期間使用槍頭或細(xì)胞刮可能將貼壁細(xì)胞刮至裂解液中以提高蛋白濃度，裂解完畢后，收集裂解液于1.5 mL離心管中，13 000 r·min-1離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，-80 ℃冰箱保存。

1.3.11 Western blot檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析 根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書對(duì)所提取的蛋白進(jìn)行定量分析，定量后加入蛋白上樣緩沖液(蛋白∶蛋白上樣緩沖液=4∶1),置于水浴鍋中99 ℃煮沸10 min，每孔加入20 μg蛋白與5 μL蛋白彩虹Marker，并設(shè)置3個(gè)重 復(fù)，60 V電泳30 min、110 V電泳70 min，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)PVDF膜(100 mA，2 h)、封閉(5%脫脂奶粉TBST溶液，37 ℃、2 h)，在將PVDF膜放入TBST稀釋的兔抗CTSD(1∶2 000)、兔抗β-actin(1∶3 000)、兔抗BMPR-IB(1∶2 000)、兔抗FSHR(1∶1 500)、兔抗INHA(1∶1 000)一抗溶液中4 ℃孵育16 h。第二天回收一抗，TBST洗膜3次，每次10 min。在將PVDF膜放入按1∶2 000稀釋比稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔的二抗溶液中，37 ℃孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，最后加入ECL超敏化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色，并將PVDF膜置于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像，使用Image J軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析，SPSS 19.0軟件對(duì)差異表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增檢測(cè)相關(guān)引物特異性

以卵巢組織cDNA第一鏈為模板，RT-PCR擴(kuò)增CTSD基因CDS區(qū)。以細(xì)胞cDNA第一鏈為模板，PCR擴(kuò)增檢測(cè)功能基因、細(xì)胞凋亡因子與細(xì)胞周期蛋白因子的熒光定量引物特異性，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。由圖1可知，PCR擴(kuò)增出的CTSD基因CDS區(qū)引物條帶較亮，片段大小一致，可進(jìn)行膠回收試驗(yàn)。功能基因、細(xì)胞凋亡因子與細(xì)胞周期蛋白因子引物大小與預(yù)測(cè)大小一致，條帶單一、明亮且無(wú)非特異性擴(kuò)增，可用于RT-qPCR分析。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Agarose gel electrophoresis to detect PCR amplification products

2.2 pEGFP-N3-CTSD真核表達(dá)載體的鑒定

將從卡那霉素的LB平板中挑取的白斑進(jìn)行菌液PCR反應(yīng)，初步驗(yàn)證并篩選真核表達(dá)載體是否構(gòu)建成功，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2A)，PCR擴(kuò)增出與CTSD基因CDS區(qū)大小一致的目的片段，初步篩選該菌液為陽(yáng)性菌液，測(cè)序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，黔北麻羊CTSD基因CDS區(qū)片段與山羊CTSD基因CDS區(qū)片段完全吻合，序列比對(duì)正確率達(dá)100%(圖2B)，雙酶切結(jié)果表明，酶切產(chǎn)物具有上、下兩個(gè)條帶，其上條帶4 729 bp處代表pEGFP-N3空載體片段，而下條帶1 239 bp處則代表黔北麻羊CTSD基因CDS區(qū)片段，菌液PCR、測(cè)序結(jié)果及雙酶切驗(yàn)證表明,pEGFP-N3-CTSD真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

A.菌液PCR檢測(cè)結(jié)果；B.pEGFP-N3-CTSD真核表達(dá)載體部分測(cè)序結(jié)果，其中B1表示山羊CTSD基因CDS區(qū)原序列、B2表示擴(kuò)增出的黔北麻羊CTSD基因的CDS區(qū)序列；C.pEGFP-N3-CTSD真核表達(dá)載體雙酶切結(jié)果A.The result of PCR detection of bacterial liquid;B.The partial sequencing result of pEGFP-N3-CTSD eukaryotic expression vector，B1 represents the original sequence of the CDS region of the CTSD gene of goat，B2 represents the sequence of the amplified CDS region of the CTSD gene of Qianbei Ma goat;C.The result of double enzyme digestion of pEGFP-N3-CTSD eukaryotic expression vector圖2 pEGFP-N3-CTSD真核表達(dá)載體的鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of eukaryotic expression vector of pEGFP-N3-CTSD

2.3 黔北麻羊原代卵泡顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)

分別在黔北麻羊原代卵泡顆粒細(xì)胞培養(yǎng)的6、12、24、48 h進(jìn)行拍照記錄其形態(tài)變化，由圖3A可知，在細(xì)胞培養(yǎng)6 h時(shí)，已基本貼壁，但大都成“點(diǎn)”狀，部分成“條”狀，細(xì)胞輪廓不明顯。細(xì)胞培養(yǎng)至12 h時(shí)，已基本定形，輪廓開(kāi)始明顯。到24 h時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始變大、變圓，紡錘形已十分明顯，數(shù)量也成倍增加。48 h時(shí)，細(xì)胞數(shù)量已占滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶的70%～80%，隔天便可進(jìn)行消化鋪板或傳代試驗(yàn)。

A.細(xì)胞分離培養(yǎng)6 h；B.細(xì)胞分離培養(yǎng)12 h；C.細(xì)胞分離培養(yǎng)24 h；D.細(xì)胞分離培養(yǎng)48 hA.Cell isolation and culture for 6 h；B.Cell isolation and culture for 12 h；C.Cell isolation and culture for 24 h；D.Cell isolation and culture for 48 h圖3 黔北麻羊卵泡顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng)的形態(tài)變化(100×)Fig.3 Morphological changes of follicular granulosa cells from Qianbei Ma goat (100×)

2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果檢測(cè)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白組呈現(xiàn)一片漆黑(圖4A)，pEGFP-N3空載體轉(zhuǎn)染組、pEGFP-N3-CTSD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組因含有綠色熒光蛋白GFP在藍(lán)色光源的激發(fā)下，細(xì)胞中發(fā)出大量的綠色熒光(圖4B和4C中高亮部分)，且細(xì)胞6孔板中無(wú)漂浮的死細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量占比80%以上，初步證實(shí)pEGFP-N3空載體與pEGFP-N3-CTSD重組質(zhì)粒已導(dǎo)入細(xì)胞，但還需要進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄與翻譯水平上進(jìn)行判斷。

A.空白組；B.pEGFP-N3組；C.pEGFP-N3-CTSD組A.Blank group;B.pEGFP-N3 group;C.pEGFP-N3-CTSD group圖4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞熒光圖(100×)Fig.4 Fluorescence of granulosa cells transfected with recombinant plasmid (100×)

2.5 重組質(zhì)粒在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)效率驗(yàn)證

本研究使用RT-qPCR與Western blot技術(shù)分別在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平上檢測(cè)重組質(zhì)粒的真核表達(dá)效率。由圖5可知，相對(duì)于空載體pEGFP-N3，重組質(zhì)粒pEGFP-N3-CTSD轉(zhuǎn)染后在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平上均能夠極顯著上調(diào)CTSDmRNA與蛋白在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)(P<0.01)，說(shuō)明重組質(zhì)粒的真核表達(dá)效率較高，可用于下一步分析與檢測(cè)。

圖5 重組質(zhì)粒表達(dá)效率檢測(cè)Fig.5 Recombinant plasmid expression efficiency detection

2.6 重組質(zhì)粒對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的影響

CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示(圖6)，pEGFP-N3-CTSD轉(zhuǎn)染后在被檢測(cè)的6個(gè)時(shí)間段內(nèi)顆粒細(xì)胞的增殖水平均低于pEGFP-N3空載體組，且除了0與6 h外，在其余4個(gè)時(shí)間段的增殖檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒pEGFP-N3-CTSD對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的抑制作用均達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)，說(shuō)明CTSD的高表達(dá)可以抑制顆粒細(xì)胞的增殖。

圖6 pEGFP-N3-CTSD轉(zhuǎn)染后顆粒細(xì)胞的增殖情況Fig.6 Proliferation of granulosa cells after pEGFP-N3-CTSD transfection

2.7 重組質(zhì)粒對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比于pEGFP-N3，pEGFP-N3-CTSD轉(zhuǎn)染后能夠極顯著促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡(P<0.01)，說(shuō)明CTSD的高表達(dá)會(huì)促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，為進(jìn)一步闡明其促凋亡機(jī)制，本試驗(yàn)研究了細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)，pEGFP-N3-CTSD在轉(zhuǎn)染后能極顯著上調(diào)促凋亡基因Bax與Caspase-3的表達(dá)(P<0.01)，對(duì)抗凋亡基因Bcl-2起到了顯著的下調(diào)作用(P<0.05)。

A1～A3.pEGFP-N3對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果；B1～B3.pEGFP-N3-CTSD對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果；C.pEGFP-N3-CTSD轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞凋亡率；D.pEGFP-N3-CTSD對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響A1-A3.The detection results of pEGFP-N3 on granulosa cell apoptosis；B1-B3.The detection results of pEGFP-N3-CTSD on granulosa cell apoptosis；C.The apoptosis rate after pEGFP-N3-CTSD transfection；D.The effect of pEGFP-N3-CTSD on the expression of apoptosis-related factors圖7 重組質(zhì)粒pEGFP-N3-CTSD對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.7 Effect of recombinant plasmid pEGFP-N3-CTSD on apoptosis of granulosa cells and related genes expression

2.8 重組質(zhì)粒對(duì)顆粒細(xì)胞周期及相關(guān)基因表達(dá)的影響

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)重組質(zhì)粒pEGFP-N3-CTSD對(duì)細(xì)胞周期的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8，相比于pEGFP-N3空載體組，pEGFP-N3-CTSD轉(zhuǎn)染后能極顯著上調(diào)G0/G1期及G2/M期的細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)極顯著下調(diào)S期的細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)，為進(jìn)一步了解重組質(zhì)粒pEGFP-N3-CTSD對(duì)細(xì)胞周期的影響機(jī)制，本研究還發(fā)現(xiàn)，pEGFP-N3-CTSD轉(zhuǎn)染后能極顯著上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)因子CyclinA1基因的表達(dá)(P<0.01)，能極顯著下調(diào)CyclinD2基因的表達(dá)(P<0.01)，對(duì)CyclinE基因的表達(dá)也起到了下調(diào)作用，但并未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

A1～A3.pEGFP-N3對(duì)顆粒細(xì)胞周期的檢測(cè)結(jié)果；B1～B3.pEGFP-N3-CTSD對(duì)顆粒細(xì)胞周期的檢測(cè)結(jié)果；C.細(xì)胞在各個(gè)周期所占的比率；D.pEGFP-N3-CTSD對(duì)細(xì)胞周期蛋白因子表達(dá)的影響A1-A3.The detection results of pEGFP-N3 on the granulosa cell cycle；B1-B3.The detection results of pEGFP-N3-CTSD on the granulosa cell cycle；C.The percentage of cells in each cycle；D.The effect of pEGFP-N3-CTSD on the expression of cyclin factors圖8 重組質(zhì)粒pEGFP-N3-CTSD對(duì)顆粒細(xì)胞周期及相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.8 The effect of recombinant plasmid pEGFP-N3-CTSD on granulosa cell cycle and related genes expression

2.9 重組質(zhì)粒對(duì)顆粒細(xì)胞功能相關(guān)基因與蛋白表達(dá)的影響

為了檢測(cè)CTSD對(duì)顆粒細(xì)胞中多胎性狀候選基因表達(dá)的影響，本研究使用RT-qPCR與Western blot技術(shù)檢測(cè)重組質(zhì)粒pEGFP-N3-CTSD轉(zhuǎn)染后對(duì)BMPR-IB、FSHR與INHA 在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平的表達(dá)變化，由圖9可知，相比于pEGFP-N3空載體組，pEGFP-N3-CTSD轉(zhuǎn)染后均能極顯著下調(diào)顆粒細(xì)胞中多胎性狀候選基因BMPR-IB、FSHR與INHAmRNA與蛋白的表達(dá)(P<0.01)，提示，顆粒細(xì)胞中CTSD的上調(diào)對(duì)多胎性狀候選基因的表達(dá)起到了抑制作用。

A.pEGFP-N3-CTSD轉(zhuǎn)染后對(duì)BMPR-IB、FSHR與INHA基因表達(dá)的影響；B、C.pEGFP-N3-CTSD轉(zhuǎn)染后對(duì)BMPR-IB、FSHR與INHA蛋白表達(dá)的影響A.The effect of pEGFP-N3-CTSD on the expression of BMPR-IB，F(xiàn)SHR and INHA genes after transfection；B,C.The effect of pEGFP-N3-CTSD on the expression of BMPR-IB，F(xiàn)SHR and INHA proteins after transfection圖9 重組質(zhì)粒pEGFP-N3-CTSD轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后對(duì)功能基因與蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effects of recombinant plasmid pEGFP-N3-CTSD transfected granulosa cells on the expression of functional genes and proteins

3 討 論

產(chǎn)羔性狀是山羊重要的繁殖性狀與經(jīng)濟(jì)性狀之一，而排卵率是衡量山羊產(chǎn)羔數(shù)量高低的重要指標(biāo)，有關(guān)綿羊的遺傳學(xué)研究表明，產(chǎn)羔數(shù)量與排卵率可以通過(guò)不同的基因進(jìn)行調(diào)控[21]。此外，排卵率還受到哺乳動(dòng)物卵巢卵泡的增殖分化、顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、多種激素以及生長(zhǎng)因子相互調(diào)控的影響[22]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族(TGFβ)的生長(zhǎng)因子在卵泡發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是TGF-β超家族的成員。它們?cè)谠蜕蠀⑴c骨骼的形成，但也顯示出它們是能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、形態(tài)發(fā)生和凋亡的多功能細(xì)胞因子[23]。在動(dòng)物體內(nèi)BMPs主要通過(guò)其受體(BMPRs)來(lái)發(fā)揮作用。早期研究表明，BMPR-IB可以影響垂體和卵巢的生理活動(dòng)，影響顆粒細(xì)胞的分化和排卵卵泡的成熟。同時(shí)，BMPR-IB編碼區(qū)的突變與Booroola綿羊的繁殖力完全相關(guān)(FecB突變)，F(xiàn)ecB突變對(duì)增加羊的排卵數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)具有促進(jìn)作用[24]。攜帶FecB突變的母羊能獲得更加優(yōu)良的多胎性能，故BMPR-IB可促進(jìn)山羊的產(chǎn)羔。抑制素(inhibin)也是TGF-β家族成員之一，INHA是抑制素家族中的亞型，由卵巢卵泡的顆粒細(xì)胞分泌，有研究發(fā)現(xiàn)，INHA的表達(dá)量隨著卵泡的發(fā)育而增加，在排卵前的卵泡顆粒細(xì)胞中也能夠檢測(cè)到INHA的存在，說(shuō)明INHA是影響卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子[25]。目前大量研究均集中于INHA基因的遺傳變異，其編碼區(qū)堿基位點(diǎn)的突變均能夠促進(jìn)不同物種的產(chǎn)羔(仔)數(shù)量[26-27]。卵泡刺激素受體(follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)是一種G蛋白偶聯(lián)受體，主要在哺乳動(dòng)物卵巢中表達(dá)。最新的研究證實(shí)，F(xiàn)SHR還可以廣泛表達(dá)于顆粒細(xì)胞[28]和脂肪細(xì)胞[29]等各類細(xì)胞中，其表達(dá)量與哺乳動(dòng)物各類卵泡的發(fā)育呈正相關(guān)，F(xiàn)SHR基因編碼區(qū)的突變也對(duì)不同羊種的產(chǎn)羔數(shù)具有正向意義，故研究學(xué)者多通過(guò)研究FSHR基因來(lái)探究卵泡的發(fā)育及排卵。目前，針對(duì)CTSD對(duì)山羊產(chǎn)羔性狀影響機(jī)制的研究較少。假設(shè)CTSD對(duì)山羊的產(chǎn)羔數(shù)有重要影響，故本研究構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N3-CTSD導(dǎo)入細(xì)胞后驗(yàn)證其對(duì)多胎性狀候選基因BMPR-IB、INHA與FSHR表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)在顆粒細(xì)胞中上調(diào)CTSD后能夠極顯著降低山羊多胎性狀候選基因BMPR-IB、INHA與FSHR在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平的表達(dá)(P<0.01)，即上調(diào)CTSD能夠下調(diào)BMPR-IB、INHA與FSHR的表達(dá)，提示CTSD可能通過(guò)影響顆粒細(xì)胞中多胎性狀候選基因的表達(dá)水平進(jìn)而間接地調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育，進(jìn)而調(diào)控山羊的產(chǎn)羔性狀。

近年來(lái)，排卵被描述為一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，在哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育的過(guò)程中，超過(guò)99%的卵泡會(huì)發(fā)生閉鎖而凋亡退化，只有極少數(shù)的卵泡能夠發(fā)育成熟、破裂進(jìn)而排卵[30]，而排卵能上調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[31]。本研究使用流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在顆粒細(xì)胞中上調(diào)CTSD后，能夠在被檢測(cè)的4個(gè)時(shí)間段(12、24、48、72 h)極顯著地抑制細(xì)胞的增殖，同時(shí)極顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P<0.01)。早在1996年，Deiss等[32]首次在研究中提出，CTSD參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控，可以通過(guò)不同的機(jī)制發(fā)揮作用或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?，F(xiàn)如今大量研究均已證實(shí)，CTSD能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[33]，這與本研究中流式細(xì)胞儀所展現(xiàn)的結(jié)果相符。為了進(jìn)一步研究其影響機(jī)制，本研究選取了Bcl-2(抗凋亡基因)、Bax、Caspase-3(促凋亡基因)，驗(yàn)證顆粒細(xì)胞中上調(diào)CTSD后對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTSD的高表達(dá)能夠顯著降低Bcl-2基因的表達(dá)(P<0.05)，極顯著提高Bax、Caspase-3基因的表達(dá)(P<0.01)，這更加確定了流式細(xì)胞儀檢測(cè)顆粒細(xì)胞凋亡的結(jié)果。研究表明，CTSD可以通過(guò)兩種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，當(dāng)溶酶體中CTSD釋放到細(xì)胞質(zhì)后，引發(fā)線粒體功能障礙導(dǎo)致線粒體中胱天蛋白酶激活劑的釋放，進(jìn)一步激活Caspase-3因子，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[34]，此機(jī)制與本研究結(jié)果一致。此外，Bcl-2家族(包括抗凋亡成員Bcl-2以及促凋亡成員Bax)是通過(guò)連接所產(chǎn)生的存活和細(xì)胞死亡信號(hào)來(lái)調(diào)控凋亡的主要調(diào)節(jié)劑，它們之間可以通過(guò)相互作用使線粒體膜通透性升高導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[35]，故推測(cè)，CTSD主要通過(guò)線粒體途徑引發(fā)山羊顆粒細(xì)胞的凋亡。

細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在顆粒細(xì)胞中上調(diào)CTSD后，能極顯著上調(diào)G0/G1期與G2/M期細(xì)胞比例(P<0.01)，極顯著下調(diào)S期比例(P<0.01)，這提示我們，CTSD的高表達(dá)能夠明顯地將顆粒細(xì)胞阻滯在了G0/G1期與G2/M期。一般認(rèn)為，S期與G2/M期所占的比例之和能夠反映細(xì)胞的增殖能力，在本研究中，pEGFP-N3-CTSD轉(zhuǎn)染后顆粒細(xì)胞在S期下降的比例高于G2/M期升高的比例，故S期+G2/M期顆粒細(xì)胞的總數(shù)量降低，即CTSD的高表達(dá)對(duì)顆粒細(xì)胞的增殖起到了抑制作用，這與CCK-8試劑檢測(cè)結(jié)果一致。為了進(jìn)一步探究CTSD高表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響，本研究選取了細(xì)胞周期相關(guān)因子CyclinA1、CyclinD2、CyclinE，并檢測(cè)它們?cè)谵D(zhuǎn)錄水平中的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pEGFP-N3-CTSD在轉(zhuǎn)染后能夠極顯著地提高推動(dòng)細(xì)胞從S期向G2/M期轉(zhuǎn)換的周期因子CyclinA1[36]的表達(dá)。極顯著降低CyclinD2的表達(dá)，CyclinD2是細(xì)胞周期相關(guān)因子CyclinD家族中的一個(gè)亞型，主要在細(xì)胞的G0/G1期發(fā)揮作用，在G1期的早期合成，在G1期的晚期高表達(dá)[37]，并在G1期與G1/S交界處起重要的推進(jìn)作用。故推測(cè)在本研究中CyclinD2表達(dá)量的降低可能是細(xì)胞被阻滯在G0/G1期的主要原因，但CTSD的高表達(dá)對(duì)調(diào)控細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換的周期因子CyclinE[38]的表達(dá)變化卻不顯著，細(xì)胞周期相關(guān)因子的表達(dá)變化均在本研究的流式細(xì)胞結(jié)果中得到了體現(xiàn)，故推測(cè)，CTSD的高表達(dá)主要是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞中CyclinA1、CyclinD2的表達(dá)影響顆粒細(xì)胞的增殖、分化與生理功能，進(jìn)而影響卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育與排卵。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，CTSD的高表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡并提高細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bax與Caspase-3的表達(dá)，降低細(xì)胞抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)。在顆粒細(xì)胞中上調(diào)CTSD后能通過(guò)提高細(xì)胞周期因子CyclinA1，降低CyclinD2的表達(dá)將顆粒細(xì)胞阻滯在G0/G1期與G2/M期，降低細(xì)胞在S期的數(shù)量，同時(shí)，顆粒細(xì)胞中上調(diào)CTSD后能極顯著下調(diào)多胎性狀候選基因BMPR-IB、FSHR、INHA在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平的表達(dá)量。本研究提示，CTSD可能對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞的生物學(xué)行為及山羊的多胎性狀具有重要作用，為今后進(jìn)一步探討CTSD的生物學(xué)功能及揭示CTSD在卵泡發(fā)育過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。