張金檸,錢夢(mèng)櫻,唐永杰,米思遠(yuǎn),師科榮,俞 英*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，泰安 271018)

金黃色葡萄球菌(簡(jiǎn)稱金葡菌)是奶牛乳腺炎常見和主要的致病菌之一，屬于機(jī)會(huì)性環(huán)境致病菌，感染率較其他致病菌更高且存在多種表面致病因子[1-3]，這些表面致病因子通常能夠誘發(fā)免疫反應(yīng)，是疫苗研發(fā)的關(guān)鍵[4-6]。其中，細(xì)胞壁錨定表面蛋白作為黏附素，在金葡菌的黏附過程中發(fā)揮重要作用。目前已知金葡菌能表達(dá)24種不同的細(xì)胞壁錨定表面蛋白[7]。與肽聚糖連接的表面蛋白前體經(jīng)加工后從細(xì)菌生物被膜中釋放出來，擴(kuò)散到宿主組織中協(xié)助金葡菌定植[8-9]，金葡菌能同時(shí)產(chǎn)生包括溶細(xì)胞毒素在內(nèi)的多種外毒素，導(dǎo)致宿主體內(nèi)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，引發(fā)奶牛乳腺炎，對(duì)奶牛養(yǎng)殖行業(yè)造成極大的影響[10]。

不同種的細(xì)菌黏附素種類存在差異，其中，絲氨酸富集重復(fù)蛋白 (SRRP)是革蘭陽性菌最常見的一種表面黏附素蛋白[11-12]。該家族蛋白前體N端均有1段非典型的信號(hào)肽，與信號(hào)肽相鄰的片段依次為短絲氨酸重復(fù)區(qū)域(SRR1)、非重復(fù)序列區(qū)域 (NRR)、長(zhǎng)絲氨酸重復(fù)區(qū)域(SRR2)和1段相對(duì)保守的細(xì)胞壁錨定序列(LPXTG)(該序列被分選酶識(shí)別并在成熟過程中被剪接)[3,13-16]。其中，NRR結(jié)構(gòu)域?qū)τ诮鹌暇じ叫灾陵P(guān)重要[17-18]，而SRR2可能參與將SRR1及NRR延伸到細(xì)菌表面的過程[19]。SasA蛋白(又稱為Srap)是金葡菌表面蛋白之一，屬于SRRP家族，相對(duì)分子質(zhì)量較大，由2 271個(gè)氨基酸組成。SasA的功能目前尚未完全研究清楚，但有研究結(jié)果表明，SasA能夠黏附人血小板[20-21]，且金葡菌表面蛋白A突變菌株與野生菌相比，侵染能力顯著減弱[22]。同時(shí)，在家兔模型中觀察到，該蛋白發(fā)揮血管感染毒力決定因子的作用[23]。目前，牛源金葡菌中也發(fā)現(xiàn)編碼SasA蛋白的基因，這提示SasA蛋白作為表面抗原可成為哺乳動(dòng)物金葡菌疫苗的新靶點(diǎn)。然而關(guān)于牛源金葡菌SasA蛋白與宿主細(xì)胞互作及在奶牛乳腺炎中致病作用的研究較少，因此，本試驗(yàn)重點(diǎn)研究該蛋白對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的黏附作用。

本研究主要分為兩部分，首先鑒定SasA基因在牛源金葡菌中的攜帶情況及序列相似性，再利用流式細(xì)胞儀測(cè)定SasA蛋白重組片段對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的黏附性高低。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株與細(xì)胞 試驗(yàn)采用中國(guó)北方5個(gè)荷斯坦牛場(chǎng)隨機(jī)取樣分離純化的73株牛源金葡菌菌株。目標(biāo)片段表達(dá)載體為pET21a+重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21大腸桿菌菌株，由軍事科學(xué)醫(yī)學(xué)院生物工程研究所疫苗與抗體工程研究室篩選饋贈(zèng)。NRR的各片段(NRR、NRR1-2、NRR3)及SRR1片段構(gòu)建如圖1所示。體外培養(yǎng)的Mac-T細(xì)胞系由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供。

圖1 金黃色葡萄球菌不同區(qū)段NRR片段Fig.1 S.aureus NRR of different domains

1.1.2 主要儀器 流式細(xì)胞儀(Life Technology 公司),核酸分析儀GE公司(Nano Drop),普通PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.1.3 主要試劑 純化用的Q柱、Ni柱Buffer以及PBS、NaOH、LB 液體培養(yǎng)基、100 mg·mL-1氨芐青霉素、IPTG貯存液、30%丙烯酰胺、10%過硫酸銨、pH為6.8和8.0的1 mol·L-1Tris-HCl、SDS-PAGE緩沖液、上樣緩沖液、凝膠脫色液等由實(shí)驗(yàn)室配制；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶消化液和胎牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Gibco公司，Cy3熒光染料購(gòu)自GE Healthcare公司，溶解Cy3的甲基亞砜購(gòu)自Sigma公司，PCR擴(kuò)增用的ExTaq、dNTPs、ExTaqBuffer購(gòu)自TaKaRa大連寶生物有限公司，細(xì)菌基因組提取使用Promega細(xì)胞基因組DNA樣品提取試劑盒，Western blot采用的抗體來自于小鼠的抗His單抗。

1.2 方法

1.2.1 Mac-T細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞在37 ℃條件下復(fù)蘇，離心后，棄掉上清液，加入完全培養(yǎng)液，置5% CO2、37 ℃條件下恒溫過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)90%，進(jìn)行細(xì)胞傳代，連續(xù)培養(yǎng)3代后，用于后續(xù)目標(biāo)蛋白的黏附試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)菌基因組提取 取20 μL菌液置于2 mL TSB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)，收集1 mL培養(yǎng)液，利用Promega細(xì)胞基因組DNA樣品提取試劑盒按照說明進(jìn)行金葡菌基因組DNA的提取。提取出的DNA置于2～8 ℃暫時(shí)保存，用于后續(xù)SasA基因鑒定及序列同源性分析。

1.2.3SasA基因鑒定 使用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)上下游引物，序列：5′-AGTCATAGTTTAGTGAGT- CAAGATAATCAAA-3′ (上游引物)；5′-ATTTCTT-GTTACTTCATATTTAAAAGTTGTCG-3′ (下游引物)。

PCR反應(yīng)體系：上下游引物各0.25 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL,Taq酶0.125 μL，用雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)充到25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，51.2 ℃退火90 s，72 ℃延伸35 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定SasA基因，對(duì)經(jīng)鑒定攜帶SasA基因的菌株進(jìn)行二代測(cè)序，并挑選其中測(cè)序結(jié)果較好的45株菌株利用Geneious軟件進(jìn)行保守性分析，構(gòu)建進(jìn)化樹，具體方法參考文獻(xiàn)[24]。

1.2.4 目標(biāo)片段表達(dá)試驗(yàn) 37 ℃條件下，將凍存菌株放置在加入100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜復(fù)蘇。將比例稀釋至1∶100，移至用平底燒瓶盛裝的含有100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃ 220 r·min-1條件下培養(yǎng)。當(dāng)測(cè)定到細(xì)菌懸浮液OD600 nm達(dá)0.6～0.8時(shí)，加入IPTG，使其濃度達(dá)到0.5 mmol·L-1，同樣條件下，培養(yǎng)6 h以充分誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。將懸濁液在6 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心10 min收集菌體，并用80 mL Ni柱Binding Buffer重懸菌體，然后以超聲波5 s后間隔5 s的頻率破碎菌體，時(shí)長(zhǎng)為30 min。當(dāng)觀察到細(xì)菌懸濁液清亮?xí)r，12 000g離心20 min后，取上清液，利用目標(biāo)片段構(gòu)建時(shí)帶有的his標(biāo)簽和蛋白等電點(diǎn)先后用Ni柱和Source 30Q陰離子層析柱純化，每次純化后均用SDS-PAGE分離目標(biāo)片段。

1.2.5 目標(biāo)蛋白純化及誘導(dǎo)效果檢測(cè) 柱純化出現(xiàn)蛋白峰時(shí)，收集峰后蛋白質(zhì)，用12% SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，濃縮膠80 V分離15 min，分離膠180 V分離45 min，考馬斯亮藍(lán)染液染色30 min后脫色，觀察結(jié)果。取未誘導(dǎo)表達(dá)的菌體破碎后的上清液與純化的NRR片段作對(duì)照，Western blot檢驗(yàn)結(jié)果。

1.2.6 目標(biāo)蛋白Cy3熒光標(biāo)記 將待熒光染色的蛋白置于0.1 mol·L-1pH = 9.3的Na2CO3透析液中，并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的最終濃度為1 mg·mL-1,所得的蛋白與Cy3染料結(jié)合，在避光條件下，孵育30～60 min，反應(yīng)后的混合物通過凝膠過濾柱，除去未反應(yīng)的染料，目標(biāo)蛋白被洗脫。通過全波長(zhǎng)掃描測(cè)得A280 nm以及A552 nm的值，計(jì)算Cy3標(biāo)記程度。

1.2.7 目標(biāo)片段黏附性檢測(cè) 當(dāng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(Mac-T)的細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，收集細(xì)胞并用PBS清洗，加入胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，37 ℃放置5 min，加入3倍體積的完全培養(yǎng)液終止消化。將細(xì)胞懸浮液置于1 000 r·min-1條件下離心5 min，棄去上清液，并將剩余部分用PBS反復(fù)清洗。細(xì)胞固定液重懸細(xì)胞，37 ℃固定30 min。固定后的細(xì)胞用PBS清洗3遍，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)至106個(gè)·mL-1，將熒光標(biāo)記的NRR片段、SRR1片段、BSA與細(xì)胞置于流式管中共同避光孵育1 h。SasA蛋白黏附性檢測(cè)試驗(yàn)中，加入的BSA與NRR濃度如表1，共設(shè)置7個(gè)濃度以保證最大濃度時(shí)黏附性達(dá)到飽和，進(jìn)入平臺(tái)期。NRR黏附性驗(yàn)證試驗(yàn)中，選取的NRR以及SRR1濃度為50和250 nmol·L-1。由于NRR濃度為50和100 nmol·L-1時(shí),完整的NRR與細(xì)胞結(jié)合的比例大約為40%，但100 nmol·L-1條件下略高，為使流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果更直觀，各片段間黏附性差異更加明顯，主要黏附片段定位試驗(yàn)中將各目標(biāo)片段濃度調(diào)整至100 nmol·L-1。以上每個(gè)濃度各設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。孵育完成后,用PBS清洗2次后,再另加500 μL PBS重懸細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。各組黏附效果差異顯著分析用Excel 軟件進(jìn)行t-test檢驗(yàn)，使用Graphpad Prism軟件繪圖。

表1 BSA與NRR濃度Table 1 The concentration of BSA and NRR

2 結(jié) 果

2.1 SasA鑒定和保守性分析

SasA基因鑒定主要采用PCR擴(kuò)增編碼SRR1-NRR段的基因。結(jié)果顯示，73株金葡菌中有63株含SasA基因(部分樣本電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示)，占比86.3%。對(duì)SasA基因攜帶菌株測(cè)序并將選中的45株的序列通過軟件比對(duì)構(gòu)建進(jìn)化樹(圖3)，得出基因序列一致性為97.1%。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～23.73株金黃色葡萄球菌中的前23株M.DNA marker;1-23.The first 23 strains among 73 strains of S.aureus圖2 SasA基因擴(kuò)增后電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Electrophoretic result of SasA amplification

圖3中，0.006表示該長(zhǎng)度的分支代表的基因變異度為0.006，由此可看出，這些菌株SasA基因普遍變異程度較小，基因序列具有高度同源性。

圖3 SasA基因攜帶菌株的基因進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of SasA gene-carrying strains

攜帶SasA基因的63株金葡菌菌株在采樣的5個(gè)牛場(chǎng)中的來源分布如圖4所示。圖4的結(jié)果顯示，SasA基因攜帶菌株在5個(gè)牛場(chǎng)中所占比例均高于60%，表明攜帶SasA基因的金葡菌存在一定的普遍性。

圖4 攜帶SasA基因的金葡菌菌株在5個(gè)牛場(chǎng)的分布Fig.4 Proportion of SasA gene-carrying strains in 5 dairy farms

2.2 目的蛋白的純化效果檢測(cè)

最后1次純化所得蛋白，用PBS調(diào)整蛋白濃度至 1 mg·mL-1，由ImageJ軟件分析電泳圖(圖5A、B)，得到NRR純化度為98%。最后Western blot檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)效果如圖5，圖5結(jié)果顯示，經(jīng)過誘導(dǎo)且純化后獲得的NRR量顯著高于未誘導(dǎo)樣。

M.蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未純化NRR;2.純化NRR;3～6(或7).收集的蛋白峰M.Protein marker;1.Unpurified NRR;2.Purified NRR;3-6 (or 7).Protein collected at peak圖5 Ni柱純化(A)和Q柱純化(B)的電泳結(jié)果及NRR Western blot 檢驗(yàn)結(jié)果(C)Fig.5 SDS-PAGE of NRR purified by Ni column (A),Q column (B) and Western blot of NRR (C)

2.3 SasA蛋白對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞黏附性檢驗(yàn)

通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)呈陽性的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果如圖6所示。結(jié)合NRR的Mac-T細(xì)胞數(shù)量顯著高于結(jié)合BSA的細(xì)胞數(shù)量(圖7)，說明NRR對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞存在較強(qiáng)的黏附性。

以上只展示該濃度下第1個(gè)生物學(xué)重復(fù)的流式檢測(cè)結(jié)果,下同The above figures only show the flow cytometry test results of the first repeat at different concentrations,the same as below圖6 不同濃度下與Mac-T結(jié)合的NRR-Cy3或BSA-Cy3的流式檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Flow cytometry tests of different concentrations of BSA-Cy3 or NRR-Cy3 binding to Mac-T

圖7 黏附于細(xì)胞上的NRR-Cy3與BSA-Cy3比率Fig.7 Percent of NRR-Cy3 and BSA-Cy3 binding to Mac-T

2.4 NRR為主要黏附片段的驗(yàn)證試驗(yàn)

先后選取濃度為50和250 nmol·L-1的NRR及SRR1片段，熒光Cy3標(biāo)記，與Mac-T孵育1 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果顯示，NRR黏附的細(xì)胞比率極顯著高于SRR1(P<0.01，圖8、9)，表明NRR是奶牛乳源金葡菌的主要黏附片段。

圖8 不同濃度下與Mac-T結(jié)合的NRR-Cy3或SRR1-Cy3的流式檢測(cè)結(jié)果Fig.8 Flow cytometry tests of different concentrations of NRR-Cy3 or SRR1-Cy3 binding to Mac-T

為進(jìn)一步確定NRR片段中起主要黏附作用的區(qū)段，分別將濃度為100 nmol·L-1的不用熒光標(biāo)記的NRR1-2、NRR3、NRR(圖1)與100 nmol·L-1NRR-Cy3混合后與細(xì)胞孵育。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，未標(biāo)記的NRR(P<0.001)、NRR1-2(P<0.001)、NRR3(P<0.01)均對(duì)NRR-Cy3黏附Mac-T存在抑制作用。但相較之下，NRR1-2抑制作用更顯著，即發(fā)揮主要黏附作用的區(qū)域大致定位在NRR1-2區(qū)段(圖10)。

3 討 論

金葡菌與宿主細(xì)胞受體結(jié)合主要依靠一系列黏附素，黏附是金葡菌定植于奶牛乳腺上皮細(xì)胞的關(guān)鍵步驟，深入研究金葡菌的黏附作用，找到作用的受體，有利于人為干擾或抑制金葡菌黏附宿主細(xì)胞從而減少感染細(xì)胞數(shù)[25-27]。此外，有關(guān)表面黏附和免疫逃逸的基因是金葡菌疫苗重要的候選基因，因此，SasA基因分布和功能的研究也極為重要[28-29]。

有關(guān)于SasA基因人流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果顯示，人體分離純化得到的42株金葡菌菌株中84%均含SasA基因。本研究中，針對(duì)牛源金葡菌SasA基因的攜帶情況進(jìn)行調(diào)查，采集到的73個(gè)樣本中86.3%含該基因，這說明SasA基因廣泛存在于在人和牛源金葡菌中[24]。

Yang等[30]對(duì)NRR結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)分析將整個(gè)片段劃分為4個(gè)部分，包括兩個(gè)不同的串聯(lián)鈣黏蛋白樣的模塊，1個(gè)β-折疊和1個(gè)豆科凝集素樣模塊(L-Lectin，245—751 aa)，因此SasA也被歸為類豆科植物凝集素細(xì)胞壁錨定表面蛋白。已有的研究發(fā)現(xiàn)，SasA蛋白黏附宿主細(xì)胞是通過L-Lectin結(jié)構(gòu)的識(shí)別實(shí)現(xiàn)的，這可能是導(dǎo)致本試驗(yàn)中NRR與SRR1黏附性存在顯著差異的重要原因。

*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001圖9 黏附于Mac-T細(xì)胞上的NRR-Cy3與SRR1-Cy3比率Fig.9 The proportion of NRR-Cy3 and SRR1-Cy3 binding to Mac-T

本研究在參考前人對(duì)于L-lectin 及NRR-SRR1 (48—540 aa)[19]黏附性探究的基礎(chǔ)上，單獨(dú)挑選NRR與SRR1片段(圖1)進(jìn)行黏附性差異分析驗(yàn)證了NRR的黏附性，并通過競(jìng)爭(zhēng)抑制黏附試驗(yàn)來定位主要黏附片段，發(fā)現(xiàn)NRR1-2 (230—540 aa)競(jìng)爭(zhēng)抑制完整NRR片段黏附的作用更顯著，在本研究中的所有片段中黏附力最強(qiáng)，這與結(jié)構(gòu)中L-Lectin(245—492 aa)基本相符，也解釋了NRR3的競(jìng)爭(zhēng)抑制黏附能力較弱的原因。豆科凝集素樣模塊富含堿性氨基酸，可與N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)特異性結(jié)合，與調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的唾液酸化受體的黏附過程有關(guān)[22,30]，進(jìn)一步證實(shí)了NRR在SasA黏附性調(diào)節(jié)中的重要作用，也揭示了相關(guān)受體的潛在特性。在人唾液中分離出的gp340受體能與SasA通過Neu5Ac結(jié)合，故SasA可成為人與奶牛疫苗研究共同的候選靶點(diǎn)[22]。

*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001圖10 不同區(qū)段NRR片段抑制NRR-Cy3黏附Fig.10 Inhibition of NRR-Cy3 binding to Mac-T by different NRR domains

為確定NRR1-2片段對(duì)奶牛乳腺細(xì)胞的具體影響和定位該片段與奶牛乳腺上皮細(xì)胞結(jié)合的位點(diǎn)，進(jìn)一步的研究擬尋找奶牛乳腺上皮細(xì)胞表面含有Neu5Ac的糖蛋白，制備抗NRR1-2單抗并與NRR1-2共孵育侵染純化后的該糖蛋白，通過對(duì)比單抗組與非單抗組感染程度確定NRR1-2的黏附效應(yīng)和驗(yàn)證該受體。

4 結(jié) 論

SasA基因在奶牛乳源金葡菌菌株中普遍存在，各菌株該基因的序列具有高度的保守性。除此之外，在SasA蛋白中，對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞起主要黏附作用的為NRR片段而非SRR1，大致定位在其結(jié)構(gòu)域的230—540位氨基酸。本研究為確定人與奶牛金葡菌疫苗研究共同的候選靶點(diǎn)提供了重要試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為定位牛乳腺上皮細(xì)胞SasA蛋白受體提供了參考信息。

致謝：本研究得到中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院徐俊杰研究員及團(tuán)隊(duì)成員的大力支持和指導(dǎo)。