孫 璐，宋潤杰，路 浩*，王敬龍，莫重輝，趙寶玉

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院草業(yè)科學(xué)研究所，拉薩 850002；3.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016)

1979年，Colegate等首次從灰苦馬豆(Swainsonacanescens)中分離出一種吲哚哩嗞啶生物堿，因是從灰苦馬豆中分離獲得而命名為苦馬豆素(swainsonine,SW)[1]，隨后，國內(nèi)外學(xué)者相繼從瘋草類有毒植物中分離出苦馬豆素[2-3]，并證明SW是瘋草類有毒植物的主要毒性成分，是動物采食這些植物引起神經(jīng)系統(tǒng)慢性功能障礙為特征癥狀的唯一毒素[4-5]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，該毒素可由棘豆鏈格孢菌(Alternariaoxytropis)[6-8]、綠僵菌(Metarhiziumspp.)[9-10]、豆類絲核菌(Slafractonialeguminicola)[11-12]等多種真菌產(chǎn)生，而有關(guān)真菌的苦馬豆素生物合成通路及其調(diào)控合成的催化酶基因尚不完全清楚。

有研究向培養(yǎng)基中加入不同的前體物質(zhì)，觀察SW產(chǎn)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L-哌可酸能夠顯著提高SW的產(chǎn)量[13]，確定其為SW生物合成重要的前體物質(zhì)。Lu等[14]通過對A.oxytropis進(jìn)行全基因組測序，并預(yù)測到P2C(δ1-piperideine-2-carboxylic acid)和P6C(δ1-piperideine-6-carboxylic acid)兩條將L-賴氨酸合成L-哌可酸的生物合成通路中的相關(guān)基因酵母氨酸脫氫酶(SDH)、酵母氨酸氧化酶(FAD2)和吡咯啉-5-羧酸還原酶(P5CR)等。有學(xué)者對A.oxytropis中SW生物合成相關(guān)基因SDH[15-16]進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)W的生物合成和前體物質(zhì)L-哌可酸的積累都有影響。2017年，Cook等[17]通過對產(chǎn)苦馬豆素的幾種真菌的基因組進(jìn)行測序，并將它們的產(chǎn)SW相關(guān)基因與其他產(chǎn)SW內(nèi)生真菌的基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)所有這些基因都屬于一個名為“SWN”的基因簇，其中包括swnH1、swnH2、swnK、swnN、swnR、swnA和swnT，而同種不產(chǎn)SW的內(nèi)生真菌則沒有SWN基因簇。這些基因參與編碼真菌L-哌可酸到SW生物合成的催化酶，在此基礎(chǔ)上，他們成功構(gòu)建了羅伯茨綠僵菌(M.robertsii)swnK基因敲除載體，并通過同源重組獲得了swnK缺失突變型菌株，采用LC-MS檢測法證明swnK突變菌株不再產(chǎn)SW，而將swnK基因回補(bǔ)后SW的產(chǎn)量又恢復(fù)到正常水平，說明swnK基因在SW生物合成通路中具有重要調(diào)控作用。且Alhawatema等[18]通過對S.leguminicola的swnK同源基因pks進(jìn)行RNAi研究,同樣發(fā)現(xiàn)該基因?qū)W生物合成有重要作用。隨后，2020年Luo等[19]通過對M.robertsii的SWN基因簇其他基因的研究發(fā)現(xiàn)，SW的生物合成是多分支合成通路，并不是一個線性生物合成通路。

目前，尚未有金龜子綠僵菌(M.anisopliae)中關(guān)于SWN基因簇中的其他基因作用的研究。金龜子綠僵菌是一種廣譜的昆蟲病理性真菌，且可產(chǎn)生SW[20-22]，本實(shí)驗室前期通過對M.anisopliae不同時期發(fā)酵液SW含量及SW生物合成通路相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測，發(fā)現(xiàn)swnR基因表達(dá)量的變化趨勢與苦馬豆素產(chǎn)量的變化趨勢一致，因此，推測swnR基因在M.anisopliae苦馬豆素生物合成通路中具有重要作用。本研究采用同源重組技術(shù)敲除M.anisopliae的swnR基因，研究swnR基因的缺失對M.anisopliae中SW生物合成及M.anisopliae表型的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金龜子綠僵菌(BNCC114445)由中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所提供，苦馬豆素標(biāo)品(Sigma-Aldrich)，神奇濾布Miracloth(EMD Millipore Corp，Billerica，MA，USA)，E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、pUC19質(zhì)粒、高保真酶、DNA marker、6×loading Buffer、無縫克隆試劑盒均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒pBAR-BenA由西北農(nóng)林科技大學(xué)外科實(shí)驗室保存；質(zhì)粒pBAR來自西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；苯菌靈、溶壁酶、草銨膦、氨芐青霉素購自Sigma公司；PCR引物合成及測序由北京奧科公司完成；其他國產(chǎn)化學(xué)試劑均購自楊凌三力公司。

其他培養(yǎng)基和試劑均按照文獻(xiàn)配制：SDA培養(yǎng)基(Sabouraud medium)[23]、Luria-Bertani培養(yǎng)基[24]、STC buffer和PTC Buffer[25]、TB3Buffer和再生培養(yǎng)基[26]。

1.2 金龜子綠僵菌原生質(zhì)體的制備

將金龜子綠僵菌接種于SDA培養(yǎng)基，28 ℃避光培養(yǎng)7 d后，采用“菌餅法”將其接種于SDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 180 r·min-1避光培養(yǎng)2 d后，采用滅菌后的三層神奇濾布過濾菌絲，用1.2 mol·L-1KCl將菌絲充分洗滌，加入1%蝸牛酶+1%纖維素酶+1%溶壁酶組合酶解液，30 ℃ 100 r·min-1酶解3 h，采用滅菌后的一層神奇濾布將酶消化混合物中的原生質(zhì)體過濾到50 mL無菌離心管中，用1.2 mol·L-1KCl將原生質(zhì)體充分洗滌，最后用STC緩沖液將原生質(zhì)體重懸定容至1 mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 金龜子綠僵菌swnR基因的鑒定

采用Sigma-Aldrich公司的真菌DNA提取試劑盒提取M.anisopliae的DNA，以該DNA為模板，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計金龜子綠僵菌swnR基因引物(表1)對swnR基因進(jìn)行高保真擴(kuò)增，而后采用DNA回收試劑盒對擴(kuò)增后的DNA片段進(jìn)行回收，并將回收產(chǎn)物進(jìn)行測序以確定swnR基因。

表1 本試驗所用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 swnR基因敲除及回補(bǔ)載體的構(gòu)建

采用引物L(fēng)2/R2和L4/R4擴(kuò)增獲得swnR基因的上、下游目的片段；用L3/R3引物擴(kuò)增獲得苯菌靈(殺菌劑)抗性基因(ben)；采用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/BamHⅠ對pUC19質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，然后用無縫克隆試劑盒連接swnR-I、ben、swnR-II和pUC19線性片段，重組質(zhì)粒pUC/SwnR∷Ben如圖1所示。

將重組質(zhì)粒pUC/SwnR∷Ben轉(zhuǎn)化至StellarTMCompetent Cells中，用含有100 mg·mL-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基挑選陽性克隆，并對含有目的基因片段的pUC19質(zhì)粒進(jìn)行檢測。

采用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切pBAR質(zhì)粒，用L1/R1引物 擴(kuò)增獲得swnR基因片段，然后無縫克隆連接swnR基因和pBAR線性片段，采用上述轉(zhuǎn)化方法，挑選陽性克隆。

1.5 swnR基因的敲除及鑒定

用STC緩沖液將原生質(zhì)體重懸至2×107～5×107個·mL-1，取200 μL，加入5 μg目的片段，采用PEG介導(dǎo)的方法將目的基因?qū)氲皆|(zhì)體中[26]，將原生質(zhì)體添加到含有100 μg·mL-1苯菌靈的再生下層培養(yǎng)基中，28 ℃孵育10 h后，在培養(yǎng)皿上層倒入含有300 μg·mL-1苯菌靈的再生上層培養(yǎng)基，28 ℃繼續(xù)避光培養(yǎng)，1周左右長出單菌落的轉(zhuǎn)化子，挑取單菌落轉(zhuǎn)化子至含有苯菌靈的培養(yǎng)基中，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)至穩(wěn)定，并與野生型M.anisopliae進(jìn)行比較。

提取穩(wěn)定傳代的swnR基因缺失菌株的基因組DNA，用引物L(fēng)1/R2擴(kuò)增相應(yīng)片段，用以鑒定swnR基因是否敲除。

將回補(bǔ)重組pBAR質(zhì)粒按照上述方法導(dǎo)入到突變菌株中，并采用重組質(zhì)粒本身具有的草銨膦抗性基因，將轉(zhuǎn)化子接種于含有2 mg·mL-1草銨膦的選擇培養(yǎng)基中篩選回補(bǔ)菌株，并與野生型、突變型菌株進(jìn)行比較。

1.6 swnR基因缺失菌株苦馬豆素產(chǎn)量的檢測

將野生型、穩(wěn)定傳代的突變型和回補(bǔ)型菌株接種于SDA培養(yǎng)基上，28 ℃避光培養(yǎng)7 d后采用“菌餅法”將6個菌餅(d=1 cm)接種于300 mL SDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 180 r·min-1避光培養(yǎng)7 d后收集發(fā)酵液，用甲醇(發(fā)酵液∶甲醇=1∶1)除去發(fā)酵液中的糖分，分別收集等量的發(fā)酵液揮干得其浸膏，稱取一定量的浸膏，加入800 mL甲醇及400 μL DMSO 溶解樣本，將溶解好的樣本用甲醇稀釋10倍，后用0.22 μm的濾膜過濾其上清液，使用Q Exactive質(zhì)譜儀(Thermo Fisher)分析提取物中的SW含量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 金龜子綠僵菌swnR基因突變和回補(bǔ)菌株的獲得

將在含有300 μg·mL-1苯菌靈的再生上層培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)化株接種于含有相同濃度苯菌靈的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，然后在有苯菌靈抗性的培養(yǎng)基上連續(xù)傳代至獲得穩(wěn)定的突變菌株(圖2)。然后采用真菌DNA提取試劑盒提取突變型菌株的DNA，以L1/R1為引物擴(kuò)增相應(yīng)的重組片段，并將回收的基因片段進(jìn)行測序(圖2E)。

2.2 金龜子綠僵菌swnR基因野生型、突變型和回補(bǔ)型菌株表型的觀察及其苦馬豆素產(chǎn)量的檢測

將野生型(WT)和穩(wěn)定傳代的突變型(MT)、回補(bǔ)型(CT)菌株接種于SDA培養(yǎng)基上，28 ℃避光培養(yǎng)3、5、7和10 d，分別測量直徑并拍照，結(jié)果顯示，swnR基因的缺失并不影響菌株表型(圖3A、B)。使用Q Exactive質(zhì)譜儀檢測野生型(WT)、突變型(MT)和回補(bǔ)型(CT)菌株發(fā)酵液中的苦馬豆素含量，分別為(82.91±15.92)、(5.71±2.23)、(56.42±10.82) μg·mg-1，結(jié)果顯示,swnR基因的缺失導(dǎo)致苦馬豆產(chǎn)量顯著下降，并且將swnR基因回補(bǔ)后，苦馬豆素產(chǎn)量回升。

3 討 論

研究顯示，影響原生質(zhì)體制備質(zhì)量和絲狀真菌再生的因素包括真菌的培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基成分、酶解酶的選擇、酶解的時間和溫度等[20，27]。本研究在試驗過程中發(fā)現(xiàn),M.anisopliae在SDA培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后酶解產(chǎn)生的原生質(zhì)體最多。據(jù)報道，M.anisopliae的細(xì)胞壁組成成分相當(dāng)復(fù)雜[28]，這意味著復(fù)合酶更有利于其原生質(zhì)體的釋放。而研究發(fā)現(xiàn)，M.anisopliae在使用1%蝸牛酶、1%纖維素和1%溶壁酶消化3 h后釋放的原生質(zhì)體數(shù)量達(dá)到最高這一事實(shí)也證明了這個理論。

原生質(zhì)體制備及PEG介導(dǎo)swnR轉(zhuǎn)化的最佳條件篩選(A～D)。A.原生質(zhì)體(10×40)；B.野生型菌株制備的原生質(zhì)體在普通培養(yǎng)基上的形態(tài)；C.導(dǎo)入swnR缺失載體的原生質(zhì)體在篩選培養(yǎng)基(添加300 μg·mL-1苯菌靈)上的狀態(tài)；D.野生型菌株制備的原生質(zhì)體在篩選培養(yǎng)基(添加300 μg·mL-1苯菌靈)上的狀態(tài)；E.采用L1/R1引物擴(kuò)增野生型(WT)、回補(bǔ)型(CT)和突變型(MT)基因的產(chǎn)物Screening for optimal conditions for protoplast preparation and PEG mediated swnR transformation (A-D).A.Protoplast of M.anisopliae;B.Protoplasts prepared from wild-type strains grown on common medium;C.Protoplasts with the vector of knocking out swnR gene grown on screening medium (added 300 μg·mL-1 benomyl);D.Protoplasts prepared from wild-type strains grown on screening medium (added 300 μg·mL-1 benomyl);E.PCR products using primers L1/R1 from WT,MT,and CT圖2 swnR基因突變菌株的篩選Fig.2 Screening for the mutant strain of knocking out swnR gene

野生型、突變型和回補(bǔ)型菌株的生長形態(tài)(A)、速率比較(B)和相應(yīng)發(fā)酵液中的SW含量(C)。數(shù)據(jù)表示為 **.P<0.01Phenotypic observation (A),growth rate determination (B) and Spectrometer detection of SW in fermentation broth (C) of MT,CT and WT.Data represented as n=3,**.P<0.01圖3 野生型、回補(bǔ)型、突變型菌株菌株表型的觀察及其SW產(chǎn)量的檢測Fig.3 The phenotypic observation and the content of SW in fermentation broth of MT,CT and WT

Cook等[17]和Alhawatema等[18]分別證明了swnK基因及其同源基因pks是M.robertsii和S.leguminicola中SW生物合成通路中必需的，但是目前尚無M.anisopliae中SW生物合成相關(guān)基因的研究，本實(shí)驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，M.anisopliae的swnR基因在其SW生物合成通路中可能扮演著重要的角色[29]。為了進(jìn)一步驗證swnR基因在M.anisopliae的SW生物合成途徑中的作用，構(gòu)建以苯菌靈抗性基因為篩選標(biāo)記的同源重組敲除載體，成功獲得swnR基因缺失菌株，且其發(fā)酵液中SW含量顯著降低，而Cook等[17]獲得的swnK基因缺失的M.robertsii發(fā)酵液中未檢測到SW，本研究中swnR基因缺失后，突變菌株SW產(chǎn)量顯著降低，但未完全消失，其原因可能是M.anisopliae體內(nèi)存在與swnR基因具有相同功能的催化酶基因。而SWN基因簇中的swnN基因和swnR基因可以編碼同一種還原酶，且它們都存在于可產(chǎn)SW的真菌中，因此，swnN有可以提供與swnR基因類似活性的可能，從而使得swnR基因缺失時SW生物合成途徑能夠低效運(yùn)轉(zhuǎn)。這一試驗結(jié)果進(jìn)一步驗證了Luo等[19]真菌中SW生物合成為多分支合成的結(jié)論。

為了證明突變菌株發(fā)酵液中SW含量的降低是由swnR基因的缺失造成的，本研究將野生型swnR基因回補(bǔ)到突變菌株中，發(fā)現(xiàn)回補(bǔ)菌株發(fā)酵液的SW含量有所恢復(fù)，但并未達(dá)到正常水平，Cook等[17]將野生型swnK基因回補(bǔ)到突變菌株后SW產(chǎn)量返高，這可能是由于swnK基因在回補(bǔ)菌株中的高表達(dá)所致。而本研究中回補(bǔ)菌株swnR基因條帶較弱，說明導(dǎo)入突變菌株的回補(bǔ)質(zhì)粒拷貝數(shù)較低，從而可能導(dǎo)致回補(bǔ)菌株苦馬豆素產(chǎn)量無法恢復(fù)到野生菌株的水平，這一可能性在本研究回補(bǔ)菌株苦馬豆素含量檢測的結(jié)果中也被證實(shí)。

本研究還比較了穩(wěn)定遺傳的swnR基因突變型菌株與野生型菌株在表型上的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)它們之間無顯著差異，由此可見，swnR基因的缺失僅引起SW產(chǎn)量的顯著下降，但不影響其正常生長。目前尚不清楚swnR基因的缺失是否會引起其他變化。

4 結(jié) 論

通過同源重組的方法獲得swnR基因缺失的M.anisopliae菌株，并就突變菌株的SW產(chǎn)量及其表型變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)突變菌株的SW產(chǎn)量顯著下降，而將swnR基因回補(bǔ)回突變菌株后，SW產(chǎn)量恢復(fù)顯著，這表明swnR基因在M.anisopliae的SW生物合成途徑中起重要作用，該研究為進(jìn)一步探討瘋草內(nèi)生真菌——棘豆鏈格孢菌的SW生物合成通路及相關(guān)的催化酶基因提供了重要的研究基礎(chǔ)。